层析法纯化破伤风毒素的试验研究

为了获得高纯度的破伤风毒素,用疏水层析和离子交换层析纯化破伤风毒素。破伤风毒素培养滤液经Phenyl Sepharose疏水层析除去大部分杂质,再经DEAE Sephadex离子交换层析进一步纯化。经两步层析纯化后,毒素纯度达到2000Lf/mg PN以上,回收率为52%~73%。用此方法,连续纯化五批毒素,均获得高纯度的破伤风毒素。试验证明破伤风毒素经疏水层析和离子交换层析可得到有效纯化。     

干扰素与转铁蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

利用重叠 PCR 技术将干扰素 (interferon , IFN) 基因与转铁蛋白 N 端半分子 (transferrin N-terminal half-molecule , TFN) 基因在体外融合,融合基因和单独的 TFN 基因分别克隆至真核表达载体 pPIC9 中,转化毕赤酵母 GS115 ,得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中均获得了表达 . 经 SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析、 Phenyl Sepharose Fast Flow 疏水层析纯化,获得了纯度大于 93 ％的重组融合蛋白 IFN-TFN 和纯度大于 95 ％的重组 TFN 样品 . 生物活性实验证明融合蛋白 IFN-TFN 具有抗病毒活性 . 铁饱和实验证明融合蛋白 IFN-TFN 和单独的 TFN 具有相同的铁结合能力 . 因而 TFN 可望作为 IFN 的天然运输载体 .     

甲状旁腺激素和转铁蛋白N端半分子融合蛋白在毕赤酵母中的表达

用重叠PCR技术将PTH（parathyroid hormone, 甲状旁腺激素）基因与TFN（transferrin N_terminal half_molecule, 转铁蛋白N端半分子）基因在体外融合,融合基因克隆至真核表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母GS115。转化子经甲醇诱导后,融合蛋白得到了表达并分泌到发酵上清液中。经 SP Sepharose F F阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度大于95％的PTH_TFN样品。Western blot分析及腺苷酸环化酶实验证明融合蛋白中的PTH具有与抗PTH抗体结合能力及刺激腺苷酸环化酶的活性,铁饱和实验证明融合蛋白中的TFN和单独的TFN具有相同铁结合能力。因而TFN可望作为PTH的天然运输载体。     

疏水层析分离正确折叠与错误折叠的复合干扰素

采用疏水层析纯化重组复合干扰素,成功去除了复性过程中产生的错误折叠体、聚集体及杂蛋白,并考察了配基类型、盐浓度、pH值和流速对疏水层析纯化效果的影响,结果表明采用ButylSepharose 4FastFlow、硫酸铵初始浓度0.8mol/L、缓冲液pH值8.3、线流速为90cm h时疏水层析纯化效果最佳,最终目标蛋白反相高效液相色谱检测纯度达到99.6% ,还原及非还原型SDS PAGE电泳均呈单一条带,其比活为2.3×10⁹IU/mg,回收率为36.7%。     

人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达及鉴定

化学合成人甲状旁腺激素（hPTH）全长基因,克隆到大肠杆菌表达载体pBV220和pET22b中,获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于95%的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH 结果完整,N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。     

疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b

目的采用疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b,去除干扰素样品中的二聚体,得到高纯度的干扰素用于进一步的研究。方法首先采用阳离子交换层析纯化复性重组人干扰素α2b,去除了大部分的杂蛋白,然后采用疏水相互作用层析纯化重组人干扰素α2b,去除复性过程中产生的错误折叠体和二聚体,并考察盐浓度、pH值、流速和洗脱液中尿素对疏水相互作用层析纯化效果的影响。结果硫酸铵初始浓度1.2 mol/L、缓冲液pH值6.0、流速2.5 mL/min、洗脱液中添加尿素浓度为2 mol/L时疏水相互作用层析纯化效果最佳。最终得到的重组人干扰素α2b非还原型SDS-PAGE电泳均呈单一条带。结论确定了疏水层析纯化重组人干扰素α2b的最优条件,成功提取到具有高活性、高纯度的重组人干扰素α2b纯品。     

人体鼠双微体2 C端结构域ZF&RING 重组蛋白的表达、纯化及单体结构研究

目的:通过在大肠杆菌SUMO系统中对鼠双微体2(MDM2)C端结构域ZFRING(aa.300-491)进行构建并进行表达,酶切和纯化,从而得到MDM2蛋白C端结构域的单体结构,为其后续的晶体研究及MDM2非p53依赖途径的研究提供途径。方法:利用大肠杆菌SUMO表达系统对zfring基因进行重组构建。构建成功的表达载体经诱导表达优化后,通过Ni-NTA进行亲和层析纯化,并利用SDS-PAGE及Western blot鉴定分析。纯化后的融合蛋白经ULP1酶切得到目的蛋白ZFRING,并通过Hi Trap Q FF离子交换层析检验和去除杂质DNA。最后通过分子筛检验其蛋白结构。结果:构建了SUMO-ZFRING重组载体。重组载体在大肠杆菌高效可溶性表达,纯化并酶切后的目的蛋白ZFRING以单体形式存在。结论:通过原核表达、纯化、酶切及层析发鉴定,成功获得高稳定、高纯度且为单体结构的MDM2 C端结构域ZFRING蛋白,为后续关于MDM2,尤其是其非p53依赖途径的结构学和功能学提供了思路和途径。     

嗜麦芽寡养单胞菌(DR-929)纤溶酶的发酵条件优化及其分离纯化

本试验研究了嗜麦芽寡养单胞菌（DR-929）纤溶酶的液体发酵条件及其分离纯化。最佳发酵条件为：可溶性淀粉2.0%,黄豆粉1.0%,酵母膏0.5%,NaCl 1.0%, CaCl2 0.02%,MgSO4 0.05%,种龄36h,发酵时间4d,初始pH 8.0或9.0,温度25℃,装样量30mL,接种量5%或6%。采用发酵液离心除菌,25%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Phenyl FF（high sub）疏水层析,Q-Sepharose FF离子交换层析,Superdex 75凝胶过滤层析对活性成分分离纯化。用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行检验,结果表明在SDS-PAGE中得到单一条带,分子量28.3KD。最终纯化倍数和酶活回收率分别为271.5和24.5%。     

辛酸沉淀结合阴离子交换层析纯化马IgG的研究

目的以辛酸沉淀结合离子交换层析纯化破伤风抗毒素马免疫血浆,获得高质量的马IgG,为抗毒素F(ab')2的制备奠定基础。方法通过对辛酸沉淀马血浆过程中的pH、辛酸浓度以及血浆稀释倍数的实验设计(DoE),研究不同条件对IgG纯度、效价、比活性、浊度以及过滤速度的影响,确定各工艺参数的可操作区间,并结合Capto DEAE阴离子交换层析以流穿模式进一步纯化IgG。结果马血浆经一步辛酸沉淀获得的IgG纯度(SDSPAGE)大于92%、分子排阻色谱(SEC)纯度大于95%,比活性较血浆提高2.14±0.29倍;辛酸沉淀后的IgG样品经阴离子交换层析,可有效去除聚合体以及小分子杂质,将纯度提高至95%(SDS-PAGE)和98%(SEC)。结论马血浆经辛酸沉淀和阴离子交换层析可获得高纯度、高比活的IgG。     

疏水层析结合冷乙醇沉淀纯化人血清白蛋白

将层析技术与冷乙醇工艺相结合用于人血清白蛋白的纯化 ,对各过程所采用的层析介质及层析条件进行了探索 ,得到了一条从人血浆中制备血清白蛋白的新路线 :将一步冷乙醇沉淀后的血浆上清进行脱盐除乙醇 ,用阳离子交换介质CMSepharoseFF以透过式层析的模式吸附非白蛋白组分 ,最后选用ButylSepharoseFF一步疏水层析后所得样品经SDS-PAGE银染显示一条单带 ,分析其纯度大于 99% ,计算工艺收率为 81.2%。与传统冷乙醇工艺相比较 ,该工艺最终样品纯度更高 ,且层析可以在常温下操作 ,易实现自动化控制.     

嗜热菌Bacillus fordii 3-2海因酶的纯化及性质

对自行筛选的海因酶法L-苯丙氨酸生产菌株Bacillus fordii 3-2中的海因酶进行了分离纯化及相关性质研究.该海因酶协同L-氨甲酰水解酶是海因酶法生产L-氨基酸的关键酶.B.fordii 3-2菌悬液经压力破碎离心后取上清液为粗酶液,粗酶液通过硫酸铵分级沉淀、Phenyl FF(high sub) 疏水层析以及Source 15Q离子交换层析,经SDS-PAGE分析达到电泳纯,亚基相对分子质量为55×103,海因酶的纯化回收率为20.5%,纯化倍数为149.23.该海因酶在pH 8.0～10.0的范围内具有较高的活性,在45～70℃具有很高的酶活力, 最适反应pH和温度分别为10.0 ℃和65 ℃.纯酶易氧化失活,DTT对该酶有一定的保护作用.二价金属离子,Mn2 、Co2 及Fe2 对酶活性有显著的促进作用,而Ca2 、Cu2 等对酶活性有抑制作用.相关研究可为该菌株及海因酶的进一步开发与应用提供理论指导.     

产胶原酶的蜡样芽胞杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化

【目的】优化蜡样芽胞杆菌R75E菌株产胶原酶的条件,并通过蛋白分离纯化技术获得高纯度胶原酶。【方法】利用单因素及正交试验优化蜡样芽胞杆菌R75E产胶原酶的发酵条件及发酵培养基,将发酵液离心除菌后得到粗酶液,对其依次通过硫酸铵分级沉淀、Butyl FF疏水层析及SuperdexTM 200凝胶过滤层析等方法对目标胶原酶进行分离纯化,利用SDS-PAGE电泳检测其纯度。【结果】优化后发酵条件为培养温度41°C、接种量6%、培养时间36 h,优化后发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、起始p H 7.0,粗酶液酶活力较优化前提高了2.9倍;将该粗酶液经过一系列纯化后得到纯度超过90%的胶原酶产物,其纯化倍数和回收率分别为18.4和1.1%。【结论】获得蜡样芽胞杆菌R75E的最佳产酶条件,并对胶原酶分离纯化的方法进行了探索,为微生物胶原酶的开发应用奠定基础。     

条斑紫菜蛋白酶解产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂纯化及特性

以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标,优选出1398中性蛋白酶、碱性蛋白酶和氨肽酶在一定条件下复配酶解条斑紫菜蛋白制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。酶解液加入乙醇至终浓度为60%以沉淀去除多糖,上清液为α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品。该粗品利用SP Sepharose High Performance阳离子交换层析、Sephadex G-10凝胶层析和Mono Q阴离子交换层析进行分离纯化,获得一种肽类α-葡萄糖苷酶抑制剂(LGI)。LGI经反向高效液相层析测定纯度为62.4%,基本特性分析显示其具较好的温度和pH稳定性,对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50值为97.36μg/mL,属于一种非竞争性抑制剂。     

重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U／mL,蛋白浓度为3～4.5mg／mL,比活性约为20-30U／mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98％以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。     

药用级微生物谷氨酰胺转胺酶的纯化工艺研究

为了提高谷氨酰胺转胺酶的纯度和扩展在医药领域的应用,探索了一种适合工业化生产的、安全高效的微生物谷氨酰胺转胺酶纯化方法。轮枝链霉菌发酵后,经离心10 000 r/min 4℃除去菌体,调节发酵液电导率至4.1mS/cm和pH6.0后,以直线流速60cm/h通过SP Sepharose FF阳离子交换层析柱对目的蛋白高 选择性和高载量地捕获,再通过phenyl sepharose 6 FF（high sub）疏水层析柱进行精细纯化。纯化后经SDS-PAGE鉴定纯度达到95%以上,HPLC分析纯度> 99%。鲎试剂测定内毒素含量为0.013EU/ml,达到中国药典中血制品要求的低于0.15EU/ml标准。     

重组人长效促卵泡激素FSH-CTP的纯化工艺研究及鉴定

为了获得高纯度的重组人长效促卵泡激素FSH-CTP,收集表达FSH-CTP的CHO细胞培养上清,经过染料亲和层析、DEAE阴离子交换层析以及疏水层析三步层析制备,所得样品进行分子量、等电点测定和Western Blot鉴定,雌性大鼠卵巢增重法测定体内生物活性。结果显示:经3步纯化所得样品纯度可达98%以上,表观分子量约为47 k Da,MALDI-TOF-MS测得结果为35.2 k Da,等电点4.0~2.8,Western Blot结果呈阳性,测活结果表明,FSH-CTP的活性比重组人卵泡刺激素明显偏高。纯化所得样品纯度良好,为该药物的进一步研究打下了基础。     

重组人MBD4蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

为获得重组人MBD4蛋白,将编码MBD4的开放式阅读框（ORF）插入原核表达载体pGEX6P1 GST基因下游的多克隆位点（MCS）.将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3) 菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达.用谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B亲和介质从菌体裂解液中纯化了GST-MBD4融合蛋白.经过Prescision protease专一性裂解成功去除了融合蛋白上的GST标签.通过Mono Q阴离子交换层析获得了纯度达94%以上的MBD4蛋白,该蛋白具有甲基化DNA结合和糖苷酶生物活性.     

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。【方法】利用硫酸铵盐析,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化,SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量,采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2,分子质量分别约为37 kD和45 kD。以酪蛋白为底物时,P1的Km=8.36 g/L,Vm=12.95μg/(mL·min),最适反应条件为pH 8.0、45°C;P2的Km=4.11 g/L,Vm=4.86μg/(mL·min),最适反应条件为pH 7.0、45°C。两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低。P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。【结论】两种蛋白酶的酶学性质存在差异;两者对疏水氨基酸构成的肽键具有选择性,但其作用基团存在特异性。这些研究结果将为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。     

研究报告重组人GPx7的原核表达、纯化及其抗肿瘤活性检测

研究大肠杆菌表达重组人谷胱甘肽过氧化物酶7（glutathione peroxidase 7,GPx7）,并对纯化精制的重组人GPx7进行体内抗肿瘤活性检测。以质粒pCDNA3.1（-）-GPx7为模板,PCR 扩增获得N-端去除信号肽的 GPx7 基因片段,构建的重组质粒pET24A-GPx7在E.coli BL21（DE3）中诱导表达。采用Sulfopropyl强阳离子交换层析和Superdex 75分子排阻层析纯化精制获得原核表达的重组人GPx7蛋白。该蛋白的体外催化活性微弱,但S180荷瘤小鼠连续14d注射GPx7蛋白后,肿瘤生长受到抑制,抑制率为29.26%,与对照组相比具有显著差异。实验结果表明,采用阳离子交换和分子排阻层析两步法可纯化精制原核表达的重组人GPx,重组人GPx7蛋白在荷瘤小鼠模型中表现出体内抗肿瘤活性。     

重组人GPx7的原核表达、纯化及其抗肿瘤活性检测

研究大肠杆菌表达重组人谷胱甘肽过氧化物酶7(glutathione peroxidase 7,GPx7),并对纯化精制的重组人GPx7进行体内抗肿瘤活性检测。以质粒pCDNA3.1(-)-GPx7为模板,PCR扩增获得N-端去除信号肽的GPx7基因片段,构建的重组质粒pET24A-GPx7在E.coli BL21(DE3)中诱导表达。采用Sulfopropyl强阳离子交换层析和Superdex 75分子排阻层析纯化精制获得原核表达的重组人GPx7蛋白。该蛋白的体外催化活性微弱,但S180荷瘤小鼠连续14d注射GPx7蛋白后,肿瘤生长受到抑制,抑制率为29.26%,与对照组相比具有显著差异。实验结果表明,采用阳离子交换和分子排阻层析两步法可纯化精制原核表达的重组人GPx,重组人GPx7蛋白在荷瘤小鼠模型中表现出体内抗肿瘤活性。