人重组卵泡刺激素和表皮生长因子对性未成熟小鼠卵母细胞和颗粒细胞复合体体外发育的作用(英文)

卵泡刺激素(FSH)对有腔卵泡和排卵前卵泡的促生长作用已被普遍接受,但关于其对腔前卵泡发育的作用报道结果不尽相同。关于表皮生长因子(EGF)对腔前卵泡的作用尚不确切。本研究目的在于探讨人重组卵泡刺激素(rechFSH)和EGF对早期卵泡发育的作用。利用胶原酶消化法从12日龄的小鼠卵巢中分离得到卵母细胞-颗粒细胞复合体(OGCs)(Fig.1)。体外每孔30~40个培养物并分别添加胎牛血清(FBS)、rechFSH和EGF。培养物每4天测量卵母细胞和OGCs直径,并每天照相。结果显示rechFSH显著促进小鼠OGCs及其卵母细胞的体外发育,这一作用可被EGF进一步增强(p<0.05)(Fig.2)。但到第八天培养结束时,培养后的OGCs卵母细胞要显著小于体内同期生长对照组(p<0.05)(Fig.3)。说明FSH和EGF在卵泡早期发育中起重要作用。     

FSH诱导卵丘细胞分泌一种促减数分裂物质

本实验利用卵母细胞的体外培养模型,将小鼠卵丘－卵母细胞复合体（CEO）和去卵丘卵母细胞（DO）在体外培养,系统研究了促性腺激素（FSH、hCG）诱导小鼠卵母细胞减数分裂的机制。结果显示,FSH能剂量依赖性地诱导CEO恢复减数分裂（Fig.1),但对DO无影响;hCG对CEO、DO皆无效果（Fig.2);用FSH预处理CEO时间达到1小时后,就能显著诱导卵母细胞成熟,2小时后作用达到最大,不再增强（Fig.3);用FSH处理CEO2小时及24小时的培养液,能诱导DO恢复减数分裂,但预处理卵丘细胞24小时的培养液,并不能诱导DO恢复减数分裂（Fig.4A);这种培养液在70℃下30分钟后,仍能刺激DO成熟（Fig.4B);甾醇类物质合成抑制剂酮康唑,可剂量依赖性地抑制FSH的促减数分裂恢复作用（Fig.5)。这些结果说明,FSH可能诱导卵丘－卵母细胞复合体中的卵丘细胞分泌一种促减数分裂恢复物质;该物质用于卵母细胞,诱导其恢复减数分裂而成熟;这种物质可能是一种甾醇类物质。     

年龄和FSH在肉牛活体取卵过程中对卵泡和卵母细胞发育的影响

用B超活体取卵技术（TVFA）对莫累灰和婆罗门杂交肉取卵,探讨年龄和FSH诱导对青年牛,经产牛及老年牛卵泡和卵母细胞发育的影响。结果显示：青年牛（12月龄）和经产牛（7－8岁）平均卵泡数（≥2mm）及＞10mm卵泡数明显高于老年牛（≥14岁）（P＜0．01）。青年牛和经产牛平均卵母细胞数及平均COC数高于老年牛（P＜0．05）。1和2级卵母细胞比例青年牛高于或等于经产牛高于老年牛,3和4级卵母细胞比例老年牛高于经产牛高于或等于青年牛（P＜0．05）。青年牛和经产牛2级卵母细胞占优势,而老年牛3级卵母细胞居多。不同剂量外源性FSH诱导后,经产牛和老年牛平均卵泡数在各剂量组之间没有显著差异（P＞0．05）;但≥6mm卵泡数及2级卵母细胞比例明显增加,而2－5mm卵泡数相应减少及裸卵和老化卵比例降低（P＜0．05）。在10次取卵过程中,青年牛和经产牛发情当天平均卵母细胞数均以后各次的数量低（P＜0．05）。研究表明：利用TVFA可从肉牛获取卵母细胞,卵泡及卵母细胞发育受年龄的影响,这可能与生理状况有关;而适量FSH秀导可以促进牛卵泡发育,提高卵母细胞质量。     

颗粒细胞EGF类因子信号通路在调控卵母细胞成熟和发育中的作用

动物体内卵泡排卵前促黄体素(luteinizing hormone, LH)诱导了卵丘颗粒细胞扩散,并启动卵母细胞恢复减数分裂。普遍认为,卵泡壁层颗粒细胞表达LH受体,卵母细胞及其周围卵丘细胞不表达LH受体,LH通过作用于卵泡壁层颗粒细胞产生信号分子,这些信号分子作用于卵丘颗粒细胞介导了LH生物作用。然而,一直以来,关于排卵前介导LH作用而诱导卵母细胞成熟的机制一直存在争议。目前研究认为,LH作用于卵泡壁层颗粒细胞后产生了EGF类因子,并与颗粒细胞的受体结合,促进了卵母细胞的成熟和发育。由于体外成熟的卵丘卵母细胞复合体来源于生长卵泡,其卵丘颗粒细胞EGF类因子信号系统不完善,目前的体外成熟培养体系难以模拟卵泡内的生理环境,导致卵母细胞体外发育能力较差,限制了这些卵母细胞的利用效率。本文综述了颗粒细胞EGF类因子信号系统、EGF类因子在调控卵母细胞成熟中的作用及对卵母细胞发育能力的影响,为优化卵母细胞体外成熟培养体系,完善卵丘颗粒细胞的EGF类因子的信号系统,进而提高卵母细胞体外成熟效率提供理论依据。     

小鼠腔前卵泡体外培养中BMP-6和GDF-9的表达

目的观察BMP-6及GDF-9蛋白在小鼠体外培养卵泡中的定位和定量表达,探讨二者与卵泡发育的关系。方法采用免疫荧光和western blot技术观察BMP-6及GDF-9在体外培养的第6、10天卵泡的定位和定量表达情况。结果在体外培养中,腔前卵泡和有腔卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均检测到BMP-6和GDF-9蛋白的表达;western blot定量显示,在卵泡体外发育的不同阶段,BMP-6和GDF-9蛋白的表达水平不同。结论 BMP-6及GDF-9蛋白存在于体外培养卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中;二者的表达水平随卵泡的发育成熟而发生变化。     

小鼠胚胎卵巢卵泡体外无血清培养体系的建立(英文)

调节原始卵泡形成、起始生长的信号目前仍知之甚少。一个重要的原因就是缺乏一个良好的研究模型。我们以妊娠１３天昆明白小鼠胚胎卵巢为研究材料,经过５天的贴壁培养后,分别用牛血清（ＦＢＳ）、无血清（ＩＴＳ）和含有人卵泡刺激素（ＦＳＨ－ＩＴＳ）培养液继续体外培养到第１９天,发现ＩＴＳ组培养的胚胎卵巢卵泡发育要显著优于ＦＢＳ组（Ｐ＜０．０１）,如：培养至第７天时（Ｐ１,相当于出生日）,卵泡数分别为２９５±１８和 ２０６±１７;培养至第１３天时（Ｐ７）,卵泡数分别为 ５９４±３１和 ２６２±２８;培养至第１９天时（Ｐ１３）,卵泡数分别为 ３７１±２５和 ５０±１１（Ｆｉｇ．１,２＆４）。ＩＴＳ处理组的绝大部分卵巢在培养早期（如：Ｐ５前）都形成了皮质－髓质样的卵泡生长模式,而ＦＢＳ处理组超过半数卵巢不能形成皮质一髓质样的卵泡生长模式;ＦＳＨ－ＩＴＳ处理组和ＩＴＳ处理组的胚胎卵巢卵泡发育并无显著差异（Ｆｉｇ．２,４＆５）。 结果提示所建立的以ＩＴＳ为血清替代物的无血清培养模型更益于小鼠胚胎卵巢卵泡的体外发育;ｈＦＳＨ不是小鼠胚胎卵巢早期发生发育所必须的。     

卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响

研究卵泡内环境对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育的影响。主要结果如下：直径≥5mm、4－4.9mm、3－3.9mm和2－2.9mm的卵泡卵母细胞体外成熟率分别为90.5%、89.7%、85.4%和67.4%,体外受精后,卵母细胞的发育能力随卵泡直径的增大而增强,直径≥5mm和4－4.9mm卵泡卵的2－细胞、3－4－细胞发育率显著高于直径2－2.9mm的卵泡卵（P＜0.05或0.01）。体外成熟培养36h、42h和48h,直径2－2.9mm卵泡卵的体外成熟率,体外受精后的卵裂率差异不显著（P＞0.05）。在体外成熟培养液中添加5％或15％的不同直径卵泡的卵泡液,各组间卵母细胞的体外成熟率,受精卵的体外发育率均无显著差异,结果表明：卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育有重要影响。     

猪卵泡内环境对其卵母细胞体外成熟与发育的影响

目的：研究猪卵泡内环境对卵母细胞体外成熟,受精及受精卵体外发育的影响。结果：直径≥5mm,4-4.9mm,3-3.9mm,2-2.9mm的卵泡内卵母细胞体外成熟率分别为90．5％,89．7％,85．4％和67．4％。体外受精后,受精卵的发育能力随卵泡直径的增大而增强,来自直径≥5mm和4－4．9mm卵泡的受精卵发育到2－细胞,3－4细胞的比率显高于来自直径2－2．9mm的卵泡受精卵（P＜0．05或0．01）,体外成熟培养36,42,48小时,直径2－2．9mm卵泡卵的体外成熟率,体外受精后的卵裂率差异不显（P＞0．05）。在体外成熟培养液中添加5％或15％的不同直径卵泡的卵泡液,各组间卵母细胞的体外成熟率,受精卵的体外发育率均无显差异。结论：卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟,受精及受精卵体外发育有重要影响。     

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞,比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量,探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组;同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组;半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量。结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞,卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89·5%、51·8%和56·6%。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化,而体外发育D8—12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0·05)。体外发育D8—12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低。     

FSH对腔前卵泡生长发育的影响

随着腔前卵泡体外培养体系的发展,对其影响因子的研究也逐渐深入,促性腺激素(FSH)在卵泡的生长和发育过程中发挥了重要的作用。本实验方法是以昆明小鼠为模型,机械分离并选择120~140μm的腔前卵泡,以添加10%血清和1%ITS的α-MEM为基础培养,分为正常添加FSH和不添加FSH组,以及在培养的0 d、2 d、4 d、6d、8 d添加FSH(100 mIU/ml)组,探讨腔前卵泡的生长发育情况。结果表明:正常添加组其卵泡的存活率、出腔率、GVBD率和2-cell胚胎率(78.7%、55.0%、35.0%和7.5%)显著高于培养液中未添加FSH的结果(分别为13.7%、8.8%、6.3%和0)(P<0.05);6 d之前添加FSH的培养组腔前卵泡能够正常生长和发育;2~4 d添加FSH可能更利于卵母细胞的成熟,以及E2的产生依赖于FSH的存在。     

体外培养条件下促性腺激素对昆明白小鼠卵母细胞成熟及卵丘扩展的影响

研究促卵泡激素（FSH）,人绒毛膜促性腺激素（hCG)对昆明白小鼠卵母细胞成熟和卵丘扩展的影响,以及体外培养时卵丘扩展与卵母细胞成熟之间的关系,FSH可以明显促进次黄嘌吟（HX）抑制条件下的卵丘－卵母细胞复合体CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展,其最佳作用剂量为100IU／L,且FSH作用30分钟即可以使CEO获得恢复减数分裂的信息,在HX存在的条件下,FSH处理后10hr,CEO卵丘明显扩展,而生发泡破裂（GVBD）则在16－20hr明显增加,所有卵丘未扩展的CEO中卵母细胞均未发生GVBD,低剂量hCG单独或与FSH共同存在,对CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展均无明显影响;高剂量hCG可以部分抑制FSH对卵母细胞成熟的促进作用,结果表明：FSH明显促进CEO卵母细胞成熟及卵丘扩展,而hCG却不具有此作用,体外培养条件下（含次黄嘌呤）,卵丘扩展是卵母细胞成熟的前提条件,但卵母细胞成熟并不需要卵丘完全扩展。     

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞，比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量，探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组；同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组；半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量。结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞，卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89.5%、51.8%和56.6%。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化，而体外发育D8—12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0.05)。体外发育D8—12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低。     

小鼠卵巢冷冻移植后卵泡发育和卵母细胞成熟的研究

本研究探讨了冷冻保存的1日龄小鼠卵巢异体异位移植后,其原始卵泡重新启动生长发育的能力。一日龄B6C2F．小鼠卵巢分离冷冻后置液氮中保存,保存1周。6个月后解冻,并将卵巢移植到8-12周龄B6C2F．受体鼠。肾脏包膜下,移植至少14d。每侧肾囊移植2枚卵巢的40只受体鼠中卵巢的回收率为45．00％（72／160）,而每侧。肾囊移植l枚卵巢的20只受体鼠的回收率为82．50％（33／40）。移植卵巢上卵泡的发育基本与体外自然生长鼠的卵巢卵泡发育情况一致。对卵巢移植19d的受体鼠用孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG）处理后,从移植卵巢上发育成熟卵泡中获得的卵母细胞在MEM0c培养基中培养16-17h,有40．90％的卵母细胞发生生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）,其中89．02％的卵母细胞发育到第二次减数分裂中期（metaphaseⅡ,MⅡ）。将剩余的卵母细胞继续培养到20～21h,又有50．83％的卵母细胞发生生发泡破裂,但其中只有21．40％的卵母细胞能够发育到MII期。以上结果说明,小鼠早期卵巢经过冷冻．解冻并异体异位移植后,其原始卵泡能够重新启动生长发育,发育后的卵泡卵母细胞能够在体外培养成熟。这些结果意味着原始卵泡或卵巢冷冻一移植技术有可能充分利用雌性生殖细胞用于濒危动物保种、建立动物基因库和人类辅助生殖等。     

哺乳动物腔前卵泡体外培养研究进展

哺乳动物卵巢中含有数以万计的腔前卵泡（preantral follicles）,仅不足1％能够发育至预排卵卵泡。建立哺乳动物腔前卵泡有效分离及体外培养技术体系,能够大量利用腔前卵泡,增加体外成熟卵母细胞数量,对哺乳动物胚胎体外生产、克隆及转基因动物生产等胚胎工程技术的研究与应用,以及在体外条件下揭示哺乳动物卵泡发育机理,都具有重要的理论意义和实用价值。鉴于卵巢质地与卵泡划、发生周期的固有差异,不同物种腔前卵泡分离方法与培养方式亦有所不同。同时,培养基类型、卵泡问相互作用、促性腺激素与细胞因子等因素均会对卵泡的体外发育产生影响。系统阐述了腔前卵泡的分离方法、培养方式以及相关因素对卵泡发育的影响,期望为从事相关研究的学者提供参考。     

处理方式不同的颗粒细胞和卵泡液对牛卵母细胞体外受精后卵裂率和囊胚率的影响

将牛的卵母细胞置于添加有不同预处理颗粒细胞及含有卵泡液的培养液或不舍有卵泡液的培养液中进行体外成熟、受精及胚胎发育培养,研究了颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对牛卵母细胞成熟、受精后卵裂率、囊胚率的影响。2178枚卵母细胞体外成熟受精后胚胎发育的对比观察结果表明：颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对卵母细胞成熟受精后胚胎的卵裂具有显著影响（P〈0．05）;颗粒细胞对囊胚的发育有显著影响（P〈0．05）;卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对囊胚的发育无显著影响（P〉0．05）。不同因素对卵裂率、囊胚率的影响表现为：颗粒细胞因素〉培养液因素〉培养液&#215;颗粒细胞交互作用。结论：TCM199培养液中添加卵泡液和单层颗粒细胞组成的培养系统用于牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的效果较好。共培养体系中的单层颗粒细胞用经酶消化分散处理后在培养箱中孵育10min的颗粒细胞替代时,胚胎的发育效果并不受影响。     

EGF在新生大鼠原始卵泡生长启动中的作用

以灵敏的增殖细胞核抗原(PCNA)为指标,研究了表皮生长因子(EGF)和FSH对新生大鼠原始卵泡生长启动的作用.结果表明,注射EGF两天,卵巢中有较多的卵泡颗粒细胞(GC)开始增殖由扁平变为立方形,到第4天时GC的增殖状况和层数更加明显;而FSH对卵泡启动在早期无明显作用,直到第7天时才有明显结果.原位杂交显示,抑制素αmRNA从出生后第5天开始表达,FSH受体(FSHR)从第6天开始表达,随后逐渐增强.提示EGF而不是FSH对原始卵泡的生长启动可能起一定的作用,抑制素也可能参与卵泡的早期发育过程.     

影响猪体细胞核移植重构胚体外发育的若干因素

以卵丘细胞为核供体细胞组成重构胚,卵裂率达到56．7％,发育至桑椹胚达11．7％、孵化囊胚率为6．7％,显著高于成纤维细胞组成的重构胚（P＜0．05）。我们研究了卵母细胞的采集方法,激活方法和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响。以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至G0或G1期,抽吸法／解剖法采集卵母细胞,体外培养33或44h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中,重构胚以钙离子载体A23817或电泳冲结合6－DMAP激活处理,体外培养6天,结果表明,卵 母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素（CB）并不影响重构胚的发育（以卵龄44h的卵母细胞为受体）;而以电脉冲结合6－DMAP激活处理能提高重构胚发育能力（以卵龄33h的卵母细胞为受体）（P＜0．05）。本研究显示,以电脉冲结合6－DMAP激活卵丘细胞重构胚,能在体外发育至囊胚。     

FSH,EGF,胰岛素促进小鼠卵母细胞体外减数分裂恢复机制的研究

FSH、EGF和胰岛素均对体外培养的小鼠卵母细胞的减数分裂的恢复起促进作用,而FSH的促进作用滞后,但作用后使卵丘细胞扩散。三者的促进作用似受卵巢颗粒细胞内游离钙和cAMP的调节。EGF和胰岛素可使培养的颗粒细胞内的cAMP水平降低;同时FSH使单个卵丘细胞内的游离Ca~(2 )水平降低,而胰岛素无影响。所以FSH、EGF和胰岛素诱发卵母细胞成熟的机制不同:EGF通过细胞内Ca~(2 )的升高和cAMP水平的下降促使卵母细胞的减数分裂恢复;FSH降低卵丘细胞内Ca~(2 )的水平,但由于卵丘细胞与卵母细胞之间的联系被打断,最终使GVBD发生;而胰岛素的作用只涉及胞内cAMP的变化。     

抗真菌药物影响生殖细胞发育机理的研究

目的：探讨抗真菌药物对促性腺激素诱导的卵母细胞成熟的机理。方法：用小鼠卵母细胞体外培养模型,将小鼠卵母细胞培养在含有次黄嘌呤（ＨＸ,卵母细胞成熟抑制物）的培养注中,观察促卵泡生成素（ＦＳＨ）、两性毒素Ｂ、酮康唑对卵母细胞减数分裂恢复的影响。结果：①ＦＳＨ（１０￣２００ＩＵ／Ｌ）显著刺激卵丘－卵母细胞复合体（ＣＥＯ）克服ＨＸ的抑制而恢复减数分裂,该作用具有剂量依赖性（Ｐ〈０．０５）;②两性霉素Ｂ（０     

奶牛卵泡超数同步发育及其卵母细胞的发育潜能

目的建立促奶牛卵泡超数同步发育的方法,并利用体细胞核移植和分子技术评价来自这些卵泡的卵母细胞发育潜能。方法用E2-P4对淘汰的高产奶牛进行联合处理后,分别对其实施不同组合的外源促性腺激素处理[FSH12h组,FSH48h组,FSH48h-LH6h组（简称LH6h组）,FSH48h-LH26h组（简称LH26h组）]以促进其卵泡超数同步发育;然后从卵泡中回收COCs进行体外成熟,排放第一极体的卵供作优质种牛的体细胞核转移（nucleartransfer,NT）受体,以评价卵的发育潜能。结果E2-P4能成功地诱导奶牛卵巢中产生一个新的卵泡起始波,并能保证卵泡在外源促性腺激素作用下实现超数同步发育;上述四组不同组合外源促性腺激素处理的卵母细胞衍生的NT重构胚经体内培养7d后,后3组的囊胚发育率显著高于FSH12h组和对照组（P〈0.01）;将这些克隆囊胚移植同步发情的受体牛子宫后,仅LH26h组的卵所获得的克隆胚能实现全程发育（直至克隆小牛出生）。经RT-PCR分析颗粒细胞中FSHr、LHr和连接蛋白43（Connexin43,Cx43）等mRNA含量变化,以及Western印迹分析其Bcl-2和Bax蛋白表达水平的变化,证实该组卵巢提供的同步发育卵泡为早期闭锁卵泡。结论E2-P4-FSH48h-LH26h组合处理可人为调控牛卵泡的同步发育;处于早期闭锁状态卵泡的卵母细胞具备较高的发育潜能。