增强原位杂交探针敏感性的研究

原位杂交(ISHH)属于固相分子杂交范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法.     

用简化的微量方法分析EGF受体基因在培养细胞中的表达

利用放射性同位素标记的基因片段或cDNA探针进行核酸分子杂交是分析基因表达的有效手段。将细胞DNA或RNA样品经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上,然后与放射性探针杂交,即Southern印迹法和Northern印迹法已被普遍采用,为了简化操作,也常使用(Dot Blot)点印迹法。利用上述技术进行基因或基因产物分析时,首先需要从细胞分离、纯化RNA和DNA。如果需     

“缺口翻译”法制备~(32)P 标记DNA探针和几种核酸杂交技术

定性或定量检测天然DNA或重组DNA中某些特殊的顺序片段,分子杂交是最常用的方法。近几年,核酸的分子杂交技术日趋完善,以不同材料为支持物的固相杂交技术取得了更为迅速的发展。核酸分子杂交方法的灵敏性主要取决于同位素标记杂交探针的比放射性强度。因此制备高比放射性探针是提高灵敏性的关键。用缺口翻译方法制备较稳定的高比放射性强度的杂交探针,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是一个理想的工具。本文介绍我们建立并改进“缺口翻译”制备P标记的探针方法,以及几种重要的核酸固相杂交技术。     

荧光探针研究新进展

自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(heterogeneousassay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneousassay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。     

人巨细胞病毒的生物素DNA探针的制备和应用

本研究用克隆的HCMV AD169株DNA片段,制备了生物素标记的DNA探针,建立了检测临床脐带血、尿标本中HCMV DNA的核酸探针杂交方法。该探针可测出100pg同源DNA,不与人胚肺细胞、Hep-2细胞DNA以及其他疱疹病毒的DNA发生反应。用核酸杂交方法检测了30份脐带血标本,有11例阳性,阳性率为33％。10例孕妇尿标本中,3例阳性,阳性率为30％。检测结果表明：我们建立的生物素标记的HCMV DNA探针的点杂交法,具有高度的特异性、敏感性,比分离病毒法更迅速,可用于HCMV感染的临床标本的病毒核酸检测。     

核酸探针技术简介

<正> 核酸探针实质上是DNA或RNA片段,这类片段或参与某种功能或具有某种特征,并往往被连上放射性物质或非放射性物质的指示剂。探针的作用是探查目的DNA或RNA的存在情况,核酸双链分子中各碱基之间有严格的配对原则,就DNA分子说,碱基间的配对总是A-T,C-G,探针的单链只有和与之相对应的称为互补的单链在一起时才能形成新的双链分子,在一个被探测的体系中如果显示     

用于DNA或RNA去盐、去蛋白及浓缩的一种方便的新方法

一种新型方便的层析柱,NENSORB~(TM)20核酸纯化柱,已被发展起来,用于从DNA和RNA中除去蛋白、盐、非掺入的放射性核苷酸以及其它低分子量物质。NENSORB20柱的使用免去了酚/氯仿抽提及乙醇沉淀这样一些典型的低得率步骤,也可用于浓缩稀释的核酸溶液。NENSORB20柱已被用来(1)从缺口转译反应混合液中纯化标记的DNA;(2)从SP6RNA聚合酶反应液中纯化标记的RNA探针;(3)纯化有末端~(35)S或~(32)P标记的DNA或RNA;(4)纯化通过M13模板上的引物延伸反应制备出的单链DNA探针;及(5)从限制性酶消化液中纯化DNA片段。 与传统的阴离子交换方法不同,这里洗脱核酸的溶液不需含有盐。DNA和RNA收集在酒精/水溶液中;彻底干燥后,核酸可直接用于进一步的生化反应。在缺口转译、末端标记、克隆、杂交、SP6聚合酶反应、蛋白质反应以及其后的实验中,经NENSORB20柱纯化的DNA或RNA样品都显示出极好的生物学活性。从含有lng到20μg核酸和蛋白的体外反应液中可得到优质、量可重复的收集物(通常60～90％)。     

用于HBV病毒快速诊断的分子信标探针设计

分子信标是一种高灵敏度、高特异性的新型荧光核酸探针.它在与互补DNA或RNA靶序列杂交时放出荧光.利用Genebank中调出已知HBV病毒ayr亚型基因组信息,通过BeaconDesigner4.0软件进行分子信标探针设计,共设计出6条分子信标探针,以便于为目前HBV病毒快速诊断提供参考.     

鸭和人乙型肝炎病毒DNA体外高效转录体系分子克隆的建立

分子生物学的发展主要在于其所必需技术的发展,体外放射标记出高比活的DNA分子探针,可提高核酸分子检测的敏感性。目前,国内使用的HBV DNA分子探针,均为缺刻转移(Nick Translation)方法标记,敏感性可检出1-2Pg,1984年Melton等报告了依DNA为横板在体外转录合成高比活的单链RNA探针(SSRNA-p)敏感10倍。     

荧光探针研究新进展

自从Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）首次进行ＤＮＡ探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｋｒｉｉｃｋａ总结了各种杂交方法,将其归为两大类;一是异相杂交（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）即液相杂交,一般届时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有     

艾滋病毒核酸探针的制备

 采用PXY104(含化学合成的HIV-env26肽基因4重串联体结构)为材料。温和裂解法提取质粒DNA,制备电泳纯化,Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶解,低融点琼脂糖凝胶电泳回收HIV-DNA片段作为核酸探针;用[α-~(32)P]dATP通过缺口移位法标记,比放射性为4.05—6.69×10~7cpm/μgDNA通过分子杂交能测出lPg的靶DNA,初步试验结果表明,在本文试验条件下,可用该探针检测与之互补的核酸分子。     

复合探针荧光定量PCR方法的建立

为了对特定基因进行实时检测,根据荧光能量转移(FRET)原理,设计及合成了一种新的FRET复合探针,该探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成,其中荧光探针5′端接一荧光素分子,3′端接一延伸阻断分子磷酸,淬灭探针3′端连接一个淬灭分子对甲基红,淬灭探针与荧光探针5′端互补,无模板时,该探针杂交形成复合探针。无荧光产生,当有模板时,荧光探针与模板杂交,荧光不能被淬灭,产生的荧光与模板量成正比。根据复合探针的反应原理,研究了该探针的FRET性质及影响因素包括淬灭探针及扩增片段长度、荧光探针与淬灭探针的合适比例及镁离子浓度。实验结果显示淬灭探针及扩增片段长度对复合探针的作用有明显的影响,本实验采用淬灭探针长21个核苷酸,扩增片段长127bp,荧光探针与淬灭探针的合适比例为1：1,镁离子浓度为3mmo1／L,可获得最佳的反应体系;该复合探针合成简单,淬灭彻底,具有良好的准确性与特异性,敏感性达10^2拷贝,并具有较宽的动力学定量范围,可对10^2—10^9拷贝范围内的待检样品进行准确的定量。复合探针技术可应用于病毒感染水平、转基因拷贝数及单核苷酸多态性等检测。     

核酸分子中碱基含量的计算

关于核酸分子中碱基含量的计算,在遗传学和高中生物教学中相当重要,但在教科书中通常没有专门讲述。我们根据碱基互补配对规律及中心法则进行归纳总结,从DNA结构、DNA复制、转录、翻译等方面探讨了DNA、RNA、蛋白质3者之间的关系,分析了核酸分子中碱基的含量。互核酸分子中碱基含量的计算1．且已知双链DNA分子中一种碱基的含量,推断其他碱基的含量：例1：一双链‘DNA分子中,（A－C）占碱基总量的Zo％。求A、T、G、C各占多少？解：在双链DNA分子中,据规律知,1．2由碱基含量推断核酸分子的结构——单链或双链、DNA或RNA…     

反义RNA网络──一种新假说

根据核酸的基本特性和最新研究成果,提出了一种新的假说──反义RNA网络：生物体内存在着许许多多小分子的基因组反义RNA以及与之互补的反反义RNA片段,由于机体的自身修饰作用（或其它机理）,它们彼此不发生复性或杂交.这种反义RNA网络一方面参与调控特定基因在特定部位、特定时间的启动和关闭,维持机体各种功能活动的相对稳定,另一方面对体内突变核酸和体外侵入核酸发挥特异性识别和排斥作用.     

基因芯片技术及其在植物上的应用

基因芯片技术（gene chip technology)是采用光导原位合成或缩微印刷等方法,将大量特定的DNA探针片段有序地固定于固相载体的表面,形成DNA微阵列,然后与待测的标记样品靶DNA或RNA分子杂交,对杂交信号进行扫描及计算机检测分析,从而获取所需的生物信息。该技术在植物研究中广泛应用于寻找特异性相关基因和新基因,基因表达分析,基因突变和多态性检测,DNA测序等。     

克隆片段DNA用于测定Epstein-Barr病毒基因组拷贝数

本文报道用非标记的克隆 EBV DNA 限制性酶解片段作标准,同时以标记的克隆片段R 作探针,经 DNA 点杂交检测每个 H_(18)细胞中 EBV 基因组拷贝数。由于实验中结合用 W 片段作标准 DNA 和探针,测定每个 Raji 细胞中所具有稳定的 EBV 基因组拷贝数,以及每个 Raji 细胞中 EBV 基因组的重复序列 W 片段数均与前人报告的结果基本一致,所以说明了本文所用方法及结果的可靠性。此项技术可在病毒阳性细胞培养物中定量测定病毒核酸,也可用于临床分子病毒学作为常规的核酸杂交技术。     

烟草花叶病毒辽宁分离物Northern杂交检测体系的建立

为了建立烟草花叶病毒辽宁分离物(TMV-LN)的高特异性、高灵敏度的分子杂交检测体系,从粗提纯的TMV-LN粒子中提取RNA,设计特异性引物通过RT-PCR扩增TMV-LN的CP和3'端非翻译区域,将片段连至p UC119载体获得重组质粒p UCTMV-PP,体外转录获得地高辛(DIG)标记的TMV-LN正义链RNA杂交检测探针,同时构建DNA检测探针作为对照。采用点印迹(Dot-blot)杂交和Northern杂交对比RNA探针和DNA探针对TMV-LN的检测特异性和灵敏性。检测结果表明,RNA探针和DNA探针在点印记杂交和Northern杂交中均表现出良好的检测特异性,RNA探针在检测灵敏度方面要略好于DNA探针,且点印迹杂交体系在病毒定性方面较为快捷,Northern杂交体系在病毒基因组RNA的定量方面具有明显优势。     

生物工程技术讲座(十) 核酸标记—生物探针法

在核酸的研究中不用放射性同位素,而用生物素(biotin)标记DNA或RNA分子做为探针来检测核酸分子的方法,是最近几年内开展起来的实验新技术。按一般常规在进行核酸的分析、鉴定以及分子杂交等实验之前,首先以所谓“DNA缺口翻译”的方法制备用同位素标记的DNA(探针)。即把待标记的已知DNA分子用核酸酶(DNase)切成缺口,加入能识别并附着在缺口上的大肠杆菌     

GFP质控芯片的初步研究

目的：建立一种质量控制芯片来监测样品标记、杂交和检测过程中的失误。方法：针对GFP基因设计的4条60mer寡核苷酸探针和1条阳性对照探针polv（U）与流感寡核苷酸探针一起打印在DAKO玻片上,并构建了GFP基因的克隆载体和体外表达载体,将从这两种重组载体上获得的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）基因的ILNA、DNA片段和人的全血样品中的DNA用限制性显示技术（Restriction Display technology,RD）扩增标记,将标记的样品和荧光标记的通用引物U分别与芯片杂交、检测,并对扫描的结果进行统计分析。结果：GFP探针与相应的样品杂交时出现阳性信号,阳性对照探针在所有的杂交中均出现阳性信号,而空白对照则未检测荧光信号。结论：建立的质控芯片具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片中的质量监控。     

基因导流杂交法于低密度基因芯片平台上检测乙肝病毒

运用基因导流杂交法在低密度基因芯片平台上检测乙肝病毒DNA（HBV DNA）。设计特异性引物,对HBV基因组DNA中的编码HBV多聚酶蛋白的一段序列进行PCR扩增;根据被扩增片段,设计保守的特异性探针,并将该探针固定在杂交膜上,制备低密度基因芯片：使用导流杂交法将上述扩增产物和低密度基因芯片进行杂交,根据显色反应判断被检测样本有无HBV DNA。基因导流杂交法在低密度基因芯片平台上可以方便、快速、准确地检测乙肝病毒。