短小芽孢杆菌的遗传转导

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)噬菌体PP5在碱性蛋白酶生产菌珠B.pumilus 289中能进行普遍性转导。PP5对于B.pumilus 289的营养标记的转导频率为10~(-6)转导子/PFU。对于B.pumilus 1037和B.pumilus 289之间的链霉素抗性标记的转导频率为10~(-4)至10~(-7)转导子/PFU。从而建立了一个新的B.pumilus遗传转导系统。     

短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究

以质粒pUB110 DNA转化B. pumilus 289原生质体,转化频率为10~(-3)—10~(-9)与B.tubtilis 168系统相当;但B.pumilus 289原生质体的再生频率(0.3—12.0％)略低于B.subtilis 168(1.53—24.16％);在无选择压力条件下质粒pUB110在B.pumilus 289中经过45个世代周期,自发丢失率小于3％,同于B.subtilis 168系统。外源基因在B.pumilus 289中经25个世代周期丢失率低于5％,而在B.subtilis 168系统中则高达24％;外源基因的表达水平亦高于B.subtilis 168系统。因此,B.pumilus 289是一个值得进一步开发的基因工程受体系统。     

芽孢杆菌基因工程新载体的构建

利用从Bacillus pumilus 289中分离出的隐秘质粒pNK289(7.2kb)的复制起始调控区及启动区DNA片段和质粒pPL 601上的氯霉素乙酰基转移酶结构基因(cat-86),构建了能在B.subtilis和B. pumilus中稳定传代的质粒pNQ216(4.1kb)和pNQ402(2.8kb)。在非诱导条件下,其在含Cm的LB平皿上的外显率都比pPL600高约30％,可以用作芽孢杆菌基因克隆的质粒载体。     

Bacillus pumilus XJU-13的分离鉴定及其碱性脂肪酶酶学特性分析

目的:对从新疆精河地区一处工业污水中分离得到的一株产碱性脂肪酶细菌进行研究.方法:通过生理生化检测,16SrDNA序列同源性分析和G+Cmol%含量的测定对命名为XJU-13的这株菌进行鉴定.结果:该菌株可在pH 3.0～12.5的广泛酸碱泛围的营养肉汤培养基中生长.最适生长温度为37℃.基于16S rDNA序列同源性构建系统进化树分析表明与Bacillus pumilus clone B257聚在同一亚分枝,序列相似性达100%.数据证明XJU-13属于Bacillus pumilus.由于在氧化酶反应及淀粉水解实验与伯杰氏鉴定手册有差异,具不可比拟的pH耐受性,且脂肪酸含量与参考菌株差异较大,认为这是Bacillus pumilus中的一个新品系.该菌株产生的脂肪酶最适pH为10,最适温度为35℃,且在广泛pH(pH4-10)范围具稳定性.酶活可被Mg2+、K+、Ba2+、Pb+盐强烈抑制,被Ca2+、Cu2+、Al+及Fe2+盐激活.Zn2+对酶活无影响.结论:实验表明,XJU-13应属于B.pumilus.B.pumilus XJu-13中分离到的碱性脂肪酶有很好的特性及潜能,以期为工业应用提供数据.     

感受态细胞制备与保存方法的比较研究

目的 :确立一个能制备高转化率感受态细胞并长期维持其感受性的实验方案。方法 :比较CaCl2 法、TSS法、超高效法制备感受态细胞的效果 ,选用三者中较好的方法进一步探讨不同生长期 (OD值 0 .2～ 1.1)的细菌对制备感受态细胞的影响 ,并分别比较了不同冷冻保护剂 (7%DMSO ,10 %甘油 )于 - 2 0℃、- 80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果 :三种方法获得的感受态细胞转化率差异极显著 (P <0 .0 1)。采用超高效法 ,OD值为 0 .36 (或 0 .5 8)时收集菌体可获得 1.1× 10 8的高转化率的感受态细胞 ,以 7%的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持 10 7以上的转化率 4 0d以上     

短小芽胞杆菌Bacillus pumilus HR10增殖扩繁培养基组分优化

短小芽胞杆菌Bacillus pumilus HR10是1株优良的菌根辅助细菌(Mycorrhiza Helper Bacteria,MHB),无论单独接种或与外生菌根真菌(Ectomycorrhizal Fungi,EMF)黄色须腹菌(Rhizopogen luteous)互作,都能显著促进马尾松(Pinus massoniana)的生长。应规模应用需要,从10种碳源、8种氮源及8种无机盐中以单因素试验初步筛选出主要组分,在此基础上采用正交试验及响应面分析法优化短小芽胞杆菌HR10增殖扩繁的培养基成分。结果表明,该菌株增殖扩繁培养基最佳组分配比为黄豆粉10.332 g/L,玉米粉7.296 g/L,蛋白胨10.718 g/L,KCl 2.5 g/L,KH2PO42.5 g/L。研究结果为菌根辅助细菌短小芽胞杆菌B.pumilus HR10菌剂开发应用提供了参考依据。     

紫外诱变选育木聚糖酶高产菌株及产酶条件初步研究

以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04为出发菌株,通过紫外诱变的方法筛选得到一株木聚糖酶高产菌株B6,其酶活提高约30%.通过因素轮换试验和L9(34)正交试验结果得出B-6菌株产酶的最佳营养条件及发酵条件.结论:4%啤酒糟、2%玉米芯、2%牛肉膏、0.15%FeSO4、1.5%Na2HPO4,pH 8～9,35℃,170r/min培养60h,产酶活力达到536.72IU/mL.     

植物根际芽胞杆菌菌种资源采集及其具有过水解催化活性水解酶基因的克隆

[背景]芽胞杆菌源枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)和头孢菌素乙酰水解酶(cephalosporin acetyl hydrolase)具有较高的过水解催化活性,有商业开发价值。[目的]挖掘芽胞杆菌菌株中具有过水解酶催化活性的水解酶蛋白基因,为后续制备过水解酶及酶法合成过氧乙酸奠定基础。[方法]利用定向筛选培养基,从植物根际及纳豆产品中筛选产蛋白酶芽胞杆菌候选菌株,并利用RFLP及16S rRNA基因对其进行鉴定。从蛋白酶高产芽胞杆菌菌株中克隆枯草杆菌蛋白酶、乙酰木聚糖醋酶和头孢菌素乙酰水解酶的全长基因。[结果]从植物根际土壤及纳豆产品中共分离到85个候选菌株,RFLP及16S rRNA基因鉴定结果表明候选菌株均为芽胞杆菌,分别属于Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus pumilus和Bacillus megaterium四个类群。从B.subtilis NSYT-3克隆的枯草杆菌蛋白酶基因编码的多肽链全长381个氨基酸,从B.pumilus OSLJ-3克隆得到的乙酰基木聚糖酯酶基因编码的多肽链全长320个氨基酸,从B.subtilis NSYT-3克隆的头孢菌素乙酰水解酶基因编码的多肽链全长318个氨基酸,3D结构模拟表明这3个酶蛋白均具有α/β水解酶折叠家族蛋白结构特点。[结论]芽胞杆菌源具过水解催化活性水解酶基因的克隆,为后续开发酶法合成过氧乙酸工艺奠定了基础。     

响应面法优化Vc二步发酵新菌系产2-酮基-L-古龙酸的培养基

以短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04作为维生素C二步发酵第2步中的伴生菌,促进产酸菌产维生素C(Vitamin C,Vc)前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)的能力强于工业生产用菌株巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) B2980.采用单因素试验、Plackett-Burman(PB)试验及Box-Behnken试验对影响新菌系发酵产2-KGA的6个因素进行分析优化.结果表明,L-山梨糖、尿素、玉米浆为显著影响因子.最佳产酸条件为L-山梨糖94.95 g/L,尿素11.99 g/L,玉米浆14.13g/L.优化后产酸量提高12.31 mg/mL,产酸周期缩短6h.     

一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法

Silwet L-77是一种非离子型的表面活性剂,常用于植物的转化。本研究发现,Silwet L-77的加入也可以显著地提高大肠杆菌的转化效率。同时,我们比较了不同培养温度、不同培养浓度(OD_(600)值)及不同冷冻保护剂对感受态细胞转化效率的影响。我们发现,28℃培养E.coli至OD_(600)值为0.55~0.6之间时制备感受态细胞,利用9%的DMSO做为冷冻保护剂冷冻保存感受态细胞,转化时加入0.001 5%~0.002%的Silwet L-77,可以获得最高的转化效率。总之,该研究进一步优化了大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法。     

应用多重PCR鉴定微生物肥料常用芽孢杆菌

[目的]枯草群芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliq-wefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)是微生物肥料中常用菌种,用传统方法鉴定费时费力,有必要建立检测和鉴定这些芽孢杆菌的种特异性PCR方法.[方法]利用已登录的gyrA、rpoA和16s rRNA基因序列分别设计和筛选上述菌种的特异引物并建立多重PCR反应体系.[结果]以基因组DNA为模板,扩增芽孢杆菌、类芽孢杆菌和短芽孢杆菌3属15种的标准菌株(共33株),4个目标种分别产生了大小不同的唯一的产物,除个别种与短小芽孢杆菌引物有交叉反应外,其余参考菌株均为阴性.从23株枯草群菌株的基因组DNA扩增发现,PCR鉴定与常规鉴定结果一致.[结论]本文建立的多重PCR方法具有较好的特异性,可快速准确鉴定枯草群的4个种,在微生物肥料检测方面有良好的实用前景.     

应用16S rDNA克隆文库法分析有机物料腐熟菌剂细菌组成

应用16SrDNA克隆文库法对有机物料腐熟菌剂A和B样品中的细菌组成进行分析研究。结果表明,样品A有14个OTU,主要是融合乳杆菌(Weissella confusa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),其比例分别占总克隆文库的28.6%、30.4%和23.2%;样品B有43个OTU,主要是布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)和耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans),占总克隆文库的比例分别为18.03%、18.86%和13.12%;所得出的结果均与产品标注存在差异,样品A未提及细菌的种类,而样品B只标注短小芽孢杆菌。研究表明这一方法在微生物菌剂细菌组成分析及其质量检测中具有良好的应用前景。     

牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及其对豚鼠的免疫原性分析

为了获得预防牛病毒性腹泻病毒1型(bovine viral diarrhea virus 1,BVDV-1)感染的病毒样颗粒,扩增C-Ems-E1-E2编码区段并克隆至pFastBacDaul载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞与Bacmid重组获得Bacmid-BVDV-1,转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒B...     

实验14 M13克隆和DNA顺序分析

一、制备感受态受体菌 1.配制M13(单链DNA噬菌体)宿主菌E.coliK12 JM103的基本琼脂培养基。JM103的基因型是[△(lac pro)thi,str A,supE,end A,sbc B15,hsdR4,F′tra D36,pro AB,lac I~qz M15]。基本琼脂培养基的配制如下: (1)2×Bacto琼脂:15克琼脂粉溶于450毫升水,高压蒸汽灭菌。 (2)2×盐溶液:K_2HPO_4 10.5克,KH_2PO_4 4.5     

为小栉角蛉更换新学名

作者1988年在中国科学院登山科学考察丛书《西藏南迦巴瓦峰地区昆虫》的脉翅目(Neuroptere)论文中,曾发表有栉角蛉科(Dilaridae)2新种,其中小栉角蛉Dilar pumilus Yang(:197—198,图     

产胞外青霉素酰化酶菌株的选育

以短小杆菌（B．pumilus）B－97为出发菌株,经过连续两次紫外线诱变处理,分离得一突变株B－U－29。其酶活力为4．56U／ml,较出发菌株酶活力提高113．3％。对B－U－29菌株进行连续两次亚硝酸处理,分离得一正变稳定株B—H－29,酶活力为4．93u／ml,较出发菌株酶活力提高了20％。     

Ca2+和Sr2+诱导大肠埃希菌感受态细胞的形成及转化的影响

为研究金属离子诱导下感受态细胞形成的机理及揭示转化发生的机制,分别用Ca~(2+)和Sr~(2+)(0~140mmol/L)制备大肠埃希菌感受态细胞并转化。研究结果表明,不同浓度的Ca~(2+)和Sr~(2+)诱导的感受态细胞的效价不同,两种金属离子对大肠埃希菌细胞内外膜的通透性均有较大影响,但细胞内外膜的改变程度与转化率无直接关系;电镜结果显示,未处理的细胞呈簇聚集发生粘连现象,感受态细胞整体呈分散状态,局部发生聚集,而转化后的细胞独立存在,边缘异常清晰。     

海洋短小枯草芽胞杆菌的鉴定及抑菌活性分析

对从连云港东西连岛海泥样品中分离得到的菌株Bacillus pumilus HX2-2的分类地位、生长条件和抑菌活性进行了研究。经过形态特征、生理生化性质及16S r DNA序列分析鉴定,该菌属于短小芽胞杆菌。不同温度、盐度、pH培养条件下测定菌液吸光度OD600值,表明该菌是一株轻度嗜盐菌,最适温度、盐度、pH分别为30℃、3%、7.0~8.0。在不同病原真菌的平板抑菌活性试验中,该菌对草莓尖胞镰刀菌、马铃薯炭疽病菌和水稻立枯丝核菌表现出显著的抑菌作用。菌株B.pumilus HX2-2是一株短小芽胞杆菌,具有广谱抑菌活性,具有进一步研究的价值。     

人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。     

产纤溶酶海洋微生物B5815菌株的筛选及鉴定

采用酪素平板、纤维蛋白平板的初筛和摇瓶复筛的方法从205株海洋微生物中筛选得到4株纤溶酶活性较强的菌株,其中菌株B5815产纤溶酶活性最高,平均达258 IU/mL。通过对菌株B5815的形态特征、生理生化特性的测定及16S rDNA序列分析,综合鉴定其为短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）。