CD14蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

摘要 目的：制备CD14重组蛋白及抗CD14单克隆抗体。方法：从人外周血淋巴细胞中克隆CD14编码基因,将其连接至质粒pRSETC,构建表达质粒pRSETC/CD14,转染大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选阳性克隆、用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测CD14蛋白表达水平,应用镍柱进行亲和纯化,SDS-PAGE及Western blot进行纯化产物鉴定。纯化后的CD14蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选分泌单克隆抗体细胞株,制备单克隆抗体,利用Western blot鉴定抗体活性。结果：获得CD14编码基因,并成功进行了原核表达,SDS-PAGE显示CD14以包涵体形式表达,纯化产物的纯度超过95%。利用杂交瘤技术筛选出稳定分泌抗CD14抗体的细胞株,并制备了高纯度的单克隆抗体,抗体具有CD14蛋白结合活性。结论：成功表达纯化了CD14蛋白,并制备了抗CD14单克隆抗体,为后续开发CD14检测技术提供抗体。     

抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)单克隆抗体和多克隆抗体,建立针对EBOV NP的ELISA检测方法。方法:以重组EBOV NP免疫动物并制备多克隆抗体和单克隆抗体。在此基础上,通过优化抗体浓度、包被液等条件建立检测EBOV NP的双抗夹心ELISA方法。结果:制备出了兔多克隆抗体,筛选出2株可分泌单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株。Western blot实验结果表明兔多抗与鼠单抗的结合区域均为N端1~35氨基酸。通过优化,建立了针对EBOV NP的双抗夹心ELISA检测方法。其线性范围是31.2~1 000 ng/ml,最低检测限为2.6 ng/ml。结论:制备出了抗EBOV核蛋白的高特异性多克隆抗体和单克隆抗体,建立了定量检测EBOV核蛋白的方法。     

芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

先以芜菁花叶病毒（TuMV）免疫BAL B/C小鼠,然后取其脾细胞使之与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗TuMV单克隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞,并以之制备腹水单抗。4株单克隆抗体腹水ELISA效价在10-5～10-6之间,仅对TuMV起特异性反应。Western blot分析表明,4株单抗都能与TuMV 34kD的外壳蛋白亚基起特异反应。利用TuMV的多抗兔血清和单抗腹水建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方法,检测病叶的灵敏度为1∶5120倍,检测提纯TuMV病毒绝对量为21.9 ng。利用三抗体夹心ELISA测定出7种作物上有TuMV侵染。      

大黄鱼病原哈维氏弧菌单克隆抗体的制备及其应用

用甲醛灭活哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）GYC1108-1制备免疫原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）对杂交瘤进行筛选,阳性克隆经2－3次亚克隆后,共获得5株针对GYC1108-1的单克隆抗体。选取1B7制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为1∶3200和1∶32000。同样用灭活的哈维氏弧菌免疫新西兰大白兔,5次免疫后颈动脉采血,离心取血清,并用饱和硫酸铵法进行纯化,制备了兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体,其ELISA效价为1∶51200。利用1B7单克隆抗体和兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体以及山羊抗小鼠HRP酶标二抗,建立了检测哈维氏弧菌的三抗体夹心酶联免疫吸附试验（TAS-ELISA）方法。该方法对哈维氏弧菌的最小检出浓度为1×104个/mL。用该TAS-ELISA方法检测大黄鱼（Pseudosciaena crocea）样品,54尾患病大黄鱼中有45尾检出哈维氏弧菌,而14尾健康大黄鱼都没有检出哈维氏弧菌。由此可见,本试验建立的TAS-ELISA方法,可以用于患病大黄鱼哈维氏弧菌的快速诊断。     

抗登革病毒2型E蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

为了制备可用于胶体金快速检测试纸条的抗登革病毒2型（DEN2）E蛋白单克隆抗体（mAb）,通过基因克隆获得E基因与质粒pET32a（＋）的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPGT诱导表达重组蛋白。以DEN2重组E蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DEN2E蛋白的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类。结果表明获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞（7C7）,其抗体亚类为IgG1。Western blot显示该株mAb能特异识别重组pET32a-DEN2E蛋白。因此,成功制备出抗DEN2E的1株mAb,为建立快速特异橙测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。     

HBV前S2蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的克隆表达HBV前S2蛋白,用纯化的重组蛋白GST-S2免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗HBV前S2蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法利用含双拷贝乙肝病毒adw2亚型基因全序列的质粒pEcob6,经PCR方法扩增出HBV前S2片段,在GST表达系统中表达,表达产物用谷胱甘肽亲和层析纯化后,用于免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗前S2蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力.结果获得一株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞7A6;相对亲和力均在107以上.Western blot显示该株mAb能特异识别重组前S2蛋白.结论成功地制备出抗HBV前S2蛋白的一株mAb.     

草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达

为大量获得具有生物学活性的草鱼生长激素,对草鱼生长激素cDNA在毕赤酵母中的表达进行了研究。将草鱼生长激素cDNA克隆入毕赤酵母表达载体pGAPZ-α-B,构建表达载体pGAPZ-α-B-GH。在三磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子的调控作用下,一个类似于天然生长激素大小、分子量约22kD的蛋白获得表达,其表达量约50mg/L。Western杂交表明：表达的蛋白与兔抗草鱼生长激素的多克隆抗体特异结合,证实该表达蛋白为草鱼生长激素;受体夹心式ELISA检测表明：表达的草鱼生长激素具生物学活性,能与不同种鱼来源的肝膜受体特异结合。     

日本血吸虫重组信号蛋白14—3—3的纯化及单克隆抗体的制备

纯化日本血吸虫（中国大陆株）重组信号蛋白（rSj14—3—3）,并制备其单克隆抗体。以纯化后的rsj14-3—3蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,用杂交瘤技术制备抗rSj14-3-3的单克隆抗体,并通过ELISA方法和Westernblotting测定抗体的效价与特异性。获得了大量高纯度的rSj14-3-3蛋白：筛选出了能够稳定分泌抗rSj14．3．3单抗的杂交瘤细胞株3H6。单抗亚型为IgG1。实验依靠大肠杆菌表达系统高效表达了rSj14—3—3蛋白,并利用该蛋白制备了单克隆抗体．可用于今后血吸虫病免疫诊断的实验研究。     

群特异性蓝舌病病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备群特异性抗蓝舌病病毒（BTV）单克隆抗体,并对其特性进行鉴定,为建立检测BTV抗原及抗体的ELISA方法奠定基础。方法：用纯化的BTV颗粒为免疫抗原免疫BALB/c鼠,以大肠杆菌表达的VP7蛋白作为筛选抗原,用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株;选取抗体效价最高的一株制备BTV单克隆抗体,以该抗体为捕获抗体与8种不同血清型BTV进行ELISA反应,结果与细胞病变反应进行比对;以该抗体为竞争抗体,与12种不同血清型绵羊BTV抗血清进行竞争ELISA反应,并将结果与参比c-ELISA试剂盒结果进行比对。结果：筛选出5株稳定分泌BTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并选其中一株（3E2）制备了高纯度的单克隆抗体;该单抗用于检测不同血清型BTV,与细胞病变反应结果完全相符;用于检测不同血清型绵羊BTV抗血清,其结果与参比c-ELISA试剂盒符合率为100%,与鹿流行性出血热病毒抗原和抗体均无交叉反应。结论：制备的BTV单克隆抗体具有良好的群特异性,可用于检测不同血清型BTV抗原及BTV抗体。     

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)单克隆抗体制备及检测方法的建立

该文通过制备出特异性高的单克隆抗体,初步建立了双抗夹心ELISA定量测定CK-MB的方法,为CK-MB试剂和原料的国产化奠定重要的基础。以购入的CK-MB抗原为免疫原,对随机选取的5只6～8周龄Balb/c健康雌性小鼠进行免疫。采用有限稀释法、间接ELISA、捕获ELISA方法,最终筛选出了3株能够稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为2F6、2H3和2H9,其分泌的单克隆抗体亚型均为IgG3,腹水效价分别为1:102000、1:51200和1:102000。采用亲和层析法对3株杂交瘤细胞产生的小鼠腹水进行纯化,分光光度计测定纯化后的单克隆抗体2H3、2F6、2H9的浓度分别为5 mg/mL、6 mg/mL、6 mg/mL, SDS-PAGE结果表明,成功纯化了小鼠腹水,能够清晰地观察到轻链和重链两条带。Western blot结果表明,单克隆抗体2F6、2H3和2H9均能特异性识别CK-MB蛋白。间接ELISA及捕获ELISA方法检测显示,单克隆抗体2H3只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2H9只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2F6只与CK-MB及CK-MM发生捕获ELISA方法反应。稳定性实验表明, 3株杂交瘤细胞都能稳定分泌抗CK-MB单克隆抗体。高质量单克隆抗体的获得,为建立CK-MB检测方法奠定了基础。     

人β-actin蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白,以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞,命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：蛋白的相对分子质量为43 kDa,可溶于8 mol/L尿素;杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10^5,腹水的抗体效价为1×10^7;间接ELISA结果表明,杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后,分泌的抗体效价不变;37℃保存24 h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白,与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验,具有良好的应用价值。     

抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

制备抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体可用于研究果蝇mrj的生物学功能,使用IPTG诱导重组质粒pET28a-mrj在大肠杆菌Rosetta中表达,重组蛋白经过Ni-IDA凝胶柱亲和纯化后免疫BALB/c小鼠。然后取免疫好的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆和筛选获得了能分泌抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。腹水制备后获得单克隆抗体,通过ELISA和Western Blot对所获得的抗体进行鉴定,结果表明所制备单克隆抗体能够特异性结合于原核及真核细胞表达的MRJ蛋白,可用于研究mrj基因的生物学功能。     

PBP2a多克隆抗体制备及其乳胶凝集检测法的建立

目的制备兔抗青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)抗体,建立检测PBP2a的乳胶凝集法。方法以重组PBP2a转肽酶区蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测所制备的抗血清效价和特异性,用纯化的多抗建立乳胶凝集法。结果纯化的重组蛋白免疫家兔能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达1∶25 600,Western blot显示该抗体能有效识别原核表达及MRSA临床分离株中的PBP2a,建立了乳胶凝集法,敏感性及特异性良好。结论成功制备了抗PBP2a抗体血清,初步建立了检测PBP2a的乳胶凝集法,为有效制备高特异的单克隆抗体进而研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。     

重组甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：制备可用于甘蔗花叶病毒（ScMV）E株系（ScMV-E）检测用多克隆抗体。方法：将ScMV-E外壳蛋白（CP）基因连接到pET29a（＋）上,经PCR检测、酶切及测序鉴定获得重组质粒pET29a-CP,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组ScMV-E外壳蛋白;采用His Trap Kit纯化目的蛋白,作为抗原免疫新西兰大白兔,制备特异性抗体;通过间接ELISA、Western blot和组织印迹法检测所制备抗体的特异性。结果：SDS-PAGE分析表明,重组融合蛋白含6个组氨酸标记,相对分子质量约43000;Western blot检测显示所获得的抗体特异性良好,间接ELISA法测得血清的效价为1：81 920;甘蔗叶片的组织印迹检测结果显示杂交效果良好。结论：制备的多克隆抗体可直接用于ScMV-E检测,并有望用于制备ScMV-E检测试剂盒。     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

活化相关分泌蛋白1单克隆抗体的制备及其在保守结构域鉴定中的应用

目的:制备重组活化相关分泌蛋白1(ASP-1)的单克隆抗体,并用其鉴定保守结构域。方法:用原核表达并纯化的重组ASP-1不加佐剂免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术及有限稀释传代法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水后用间接ELISA进行抗体特异性鉴定和效价检测,利用肽结合ELISA和Western印迹鉴定单抗识别的保守结构域。结果:获得5株能稳定分泌抗ASP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且5株单抗的识别区域均为21~28氨基酸残基的保守性结构域。结论:制备了抗ASP-1的单克隆抗体,为深入研究ASP-1佐剂的活性功能区及作用机制提供了有效工具。     

牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

利用牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)接种牛肺细胞(BL),提取病毒RNA。通过RT-PCR扩增BRSV的核蛋白基因,然后定向克隆到原核表达载体pET30a,获得重组表达质粒pET30a-N。将重组质粒转化表达菌BL21(DE3),经增菌培养和IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析,成功表达出了核蛋白(N),其分子量约为49kDa。为制备BRSV核蛋白的单克隆抗体,用纯化的重组核蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。采用以BRSV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗N特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2D12与4B10。用2D12与4B10杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rN及BRSV包被的ELISA测得的效价分别是1×105和1×106及1×102和1×103。间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定D12与4B10均为IgG1/κ。特异性试验表明单抗2D12与4B10均不与牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒反应。所制备的D12与4B10可用于建立检测BRSV病原及抗体的诊断方法。     

抗登革病毒NS1单抗的制备及检测NS1方法的建立

制备抗登革病毒NS1蛋白单克隆抗体,建立检测NS1的ELISA方法。表达1~4型登革病毒NS1蛋白,将1型NS1蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体。经ELISA、Western blotting、间接免疫荧光筛选和鉴定单克隆抗体,进行纯化和HRP标记。通过鉴定每两株单抗之间是否存在竞争作用,选择非竞争单抗组合并建立NS1捕获法ELISA。结果获得7株高滴度抗NS1单抗,捕获法ELISA可以检出10ng/mL NS1。原核表达登革病毒NS1蛋白制备的单抗可以和天然病毒抗原反应,NS1捕获法ELISA可以用于登革病毒感染检测。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

草鱼生长激素单抗免疫亲和柱的制备及初步应用

用纯化的草鱼生长激素单克隆抗体偶联到CNBr活化的Sepharose4B凝胶上,制成约10ml的亲和层析柱．用该柱一步纯化了重组鲤鱼生长激素基因的表达产物．偶联有13．65mg单克隆抗体的亲和柱一次可纯化得到约0．7mg重组鲤鱼生长激素．酶联免疫受体测定表明它具有强烈的生物学活性,SDS－PAGE表明它为单一蛋白带,分子量约为22000．