转化淋巴细胞胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性及细胞内源性底物的研究

本文对增殖期的淋巴细胞胰岛素依赖性酪氨酸蛋白激酶活性及内源性废物进行了分析研究。在纯化的健康人淋巴细胞中加入适量的植物血凝素(PHA),经过72h培养即成为转化淋巴细胞(增殖期淋巴细胞)。应用~(32)P参入实验,证实转化淋巴细胞胰岛素受体具有胰岛素依赖性的酪氨酸蛋白激酶活性,与未转化的对照组相比其活性增加约9倍。Scatchard分析表明转化后淋巴细胞膜表面胰岛素受体数增加3.5倍。应用抗酪氨酸磷酸酯抗体,对胰岛素作用前后的转化与未转化淋巴细胞内,酪氨酸残基磷酸化的蛋白进行了鉴定,结果表明:除了95kD受体β亚基自身磷酸化外,45kD蛋白质也明显磷酸化,我们命名它为PP45。我们认为PP45可能是淋巴细胞中胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶的主要内源性废物,它的磷酸化是胰岛素信息传递过程级联反应的初始步骤。     

紫藤蚜肠道细菌的分离及鉴定

目的 依据微生态学原理,针对紫藤蚜的肠道细菌进行分离鉴定,为探索紫藤蚜的营养生理与肠道细菌之间的关系等提供理论依据.方法 利用传统的分离培养方法对紫藤蚜5株肠道细菌的生理生化性状进行系统研究,并针对细菌16SrDNA保守区设计通用引物进行PCR扩增、测序,将获得的16S rDNA序列与美国NCBI信息中心数据库中的发表序列细菌进行比对,分析克隆群中细菌的种属.结果 分离纯化得到的5株细菌经过鉴定,其中1、2、3号菌属于蜡状芽孢杆菌属(Bacillus cereus)、4号菌为沙雷菌属(Serratia bzio)、5号菌为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis).结论 本研究为进一步探讨紫藤蚜生长发育与肠道细菌的关系以及深入研究菌株提供工作基础.     

以STAT3为靶标的抗肿瘤药物高通量筛选模型的建立和应用

旨在建立稳定可靠的以转导与转录激活子(STAT3)为靶标的抗肿瘤高通量筛选模型,应用该模型筛选潜在的抗癌药物。利用基因重组、蛋白表达纯化技术,获得STAT3目的蛋白,使用酶联免疫吸附法(ELISA)进行高通量药物筛选,将筛选出的抑制剂在细胞水平上利用MTT比色法测定化合物对癌细胞增殖的影响。结果显示,成功构建表达载体pET-28a-STAT3;所建立的模型稳定可行,可用于以STAT3为靶标的抗肿瘤药物的高通量筛选;用该模型对8 248个样品进行筛选,在500μmol/L药物浓度下,化合物MDC6抑制率为92%,另外,进行IC50值的测定时,分子水平上最低达到3.37μmol/L,在细胞水平上可达到15.92μmol/L。建立的高通量药物筛选模型,具有操作方便、成本低、结果稳定等特点,可用于STAT3抑制剂的大规模筛选。     

抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)单克隆抗体和多克隆抗体,建立针对EBOV NP的ELISA检测方法。方法:以重组EBOV NP免疫动物并制备多克隆抗体和单克隆抗体。在此基础上,通过优化抗体浓度、包被液等条件建立检测EBOV NP的双抗夹心ELISA方法。结果:制备出了兔多克隆抗体,筛选出2株可分泌单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株。Western blot实验结果表明兔多抗与鼠单抗的结合区域均为N端1~35氨基酸。通过优化,建立了针对EBOV NP的双抗夹心ELISA检测方法。其线性范围是31.2~1 000 ng/ml,最低检测限为2.6 ng/ml。结论:制备出了抗EBOV核蛋白的高特异性多克隆抗体和单克隆抗体,建立了定量检测EBOV核蛋白的方法。     

不同浓度白花丹素对骨肉瘤细胞MG-63凋亡迁移、基质金属蛋白酶及Bcl-2、Bax、Ezrin蛋白表达的影响

目的:研究不同浓度白花丹素对骨肉瘤细胞MG-63凋亡迁移、基质金属蛋白酶(MMP)及Bcl-2、Bax、Ezrin蛋白表达的影响。方法:取对数生长期的骨肉瘤MG-63细胞,传代培养成细胞株后以随机法分成对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。其中对照组加入到0.1%浓度的DMSO完全培养基中培养,低剂量组、中剂量组、高剂量组分别加入到浓度为5、10、20μmol/L的白花丹素的有关培养基中培养。培养24 h后,采用Transwell法检测MG-63细胞迁移率、Hoechst33342染色法检测MG-63细胞凋亡率、Western blot法检测四组MG-63细胞的MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Ezrin蛋白表达水平。结果:培养24 h后,低剂量组、中剂量组、高剂量组的骨肉瘤细胞MG-63凋亡率及Bax蛋白表达水平均较对照组升高(P<0.05),且随白花丹素浓度的增加而升高(P<0.05);骨肉瘤细胞MG-63的细胞迁移率、MMP-2、MMP-9、Bcl-2及Ezrin蛋白表达水平较对照组降低(P<0.05),且随白花丹素浓度的增加而降低(P<0.05)。结论:白花丹素对骨肉瘤细胞MG-63凋亡的促进作用以及迁移的抑制作用明显,其作用机制可能与抑制骨肉瘤细胞MG-63中的MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Ezrin蛋白表达及促进Bax蛋白表达有关,且浓度越高,抑制或促进作用越明显。