大鼠海马神经元TLR4介导的MyD88依赖途径在神经炎症中的作用

目的:研究大鼠海马神经元是否有Toll样受体4(TLR4)介导的的髓样分化因子88(MyD88)依赖途径及该途径的激活在神经炎症中的作用。方法:采用体外培养7 d的新生大鼠海马神经元,细胞免疫荧光双标法鉴定海马神经元纯度。用TLR4配体脂多糖(LPS)或TLR4抗体预处理海马神经元,以激活或阻断TLR4的作用。实时定量PCR(RT-qPCR)方法检测海马神经元中MyD88、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)mRNA的表达;Westernblot方法测定海马神经元MyD88和TRAF6蛋白水平;细胞免疫荧光双标法观察海马神经元中核因子κB/P65(NF-κB/P65)的表达定位及TLR4激活或阻断后NF-κB/P65核易位情况;ELISA检测培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和一氧化氮(NO)的水平。结果:LPS能上调海马神经元MyD88和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)mRNA水平;促使NF-κB/P65转位至核;增加MyD88和TRAF6蛋白的表达;增加海马神经元培养上清中TNF-α、IL-1β和NO含量;TLR4抗体预处理能减弱LPS对海马神经元NF-κB/P65核易位作用及降低培养上清中TNF-α、IL-1β和NO的水平。结论:大鼠海马神经元有TLR4介导的的MyD88依赖途径,该途径的激活能导致TNF-α、IL-lβ和NO含量的增加。海马神经元TLR4介导的MyD88依赖途径参与了神经炎症反应,神经元不是神经炎症反应中的被动者。     

选择性剪接在Toll样受体4信号转导通路中的作用

Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)属于模式识别受体,可识别来自G-细菌细胞壁的脂多糖(lipopoly-saccharides,LPS),并通过MyD88依赖途径或MyD88非依赖途径进行信号转导,引发核因子-κB(NF-κB)和其他转录因子的表达,从而诱导细胞因子、化学趋化因子的产生,引起系统性炎症反应。选择性剪接是真核生物控制基因表达的一种重要机制,在TLR4通路中很多信号分子都存在着选择性剪接产生的异构体,且这些剪接异构体分子大都可负性调控TLR4信号转导通路。本文针对这方面的研究进展作一综述。     

TLR3免疫识别dsRNA病毒的分子机制

1984年,果蝇的Toll样蛋白被发现。13年后,人们发现了第一个与果蝇Toll蛋白同源的人Toll样受体(toll like receptor,TLR)蛋白(hTLR4)。迄今,已有10种TLR蛋白(即hTLR1～10)被发现,它们代表了一类保守的受体家族,分别识别不同的抗原。其中TLR3能专一性地识别双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),通过依赖MyD88的信号通路及不依赖MyD88的信号通路,     

炎症反应中Toll样受体对NHE蛋白家族的调节

Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)在不同的天然免疫应答中可以识别和激活不同的病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns, PAMPs),进而导致炎症。而钠氢交换体(Na~+/H~+exchanger, NHE)不仅具有调节胞内pH值和细胞容积、维持腔体微环境、影响营养吸收的作用,而且与细胞的增殖、迁移、凋亡相关。在炎症情况下,NHE的活性和膜蛋白表达都受到抑制。结肠上皮细胞TLR2激活后可通过MyD88非依赖性途径抑制NHE1活性,其抑制作用的机制与Src的聚集和PI3Ks的磷酸化有关。长期脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)暴露可激活肠巨噬细胞TLR4,通过MyD88依赖性途径(即TLR4/MyD88/NF-κB通路)导致炎症发生,并加速NHE1胞内降解,从而抑制NHE1活性;但短时间LPS暴露却提高NHE1活性。TLR5的激活可使NHE3活性增高。结肠炎患者和模型动物肠道巨噬细胞NHE3活性或/和表达量下降。在肾小管上皮细胞中,基底侧LPS刺激通过激活TLR4/MyD88/MAPK/ERK信号通路抑制管腔侧NHE3的活性,而管腔侧LPS刺激则激活TLR4/MyD88依赖性PI3K-AKT-mTOR信号通路,引起基底侧NHE1活性抑制,进而继发影响管腔侧NHE3功能。     

MyD88aa155-171功能区缺失对免疫相关细胞共刺激分子和细胞因子表达的影响

利用重组PCR的方法,克隆并构建MyD88和MyD88aa155-171功能区缺失（MyD88?155-171）载体,转染免疫相关细胞并筛选获得稳定细胞系。报告基因实验结果显示MyD88?155-171功能区缺失能够抑制转录因子NF-κB和AP-1的活性,在不同Toll样受体（TLR）配体刺激后,转染MyD88?155-171的细胞表面分子的表达低于MyD88正常表达的细胞,并且抑制表面分子CD86和B7H1在TLR配体刺激后的上调。同时,多细胞因子分析系统的检测结果表明,给予TLR配体刺激之后,MyD88-/-树突细胞表达低水平的细胞因子,转染MyD88可以使细胞因子表达明显增加,而仅表达MyD88?155-171可以明显影响IL-12,IFN- 的表达。以上结果表明MyD88功能区缺失影响免疫相关细胞表面分子和细胞因子的表达及Toll 样受体信号的传递,其在细胞内信号系统的具体作用机制还需进一步证实。     

鸡MyD88-TIR的同源模建

髓样分化因子(MyD88)是Toll受体(TLR)信号通路中的一个关键接头分子,在传递信息和介导炎症反应中具有重要的作用。对鸡MyD88(Myeloid differentiation primary response protein MyD88)的TIR(Toll-interleukin1-resistance)区域进行同源建模,并评估其可用性,为进一步研究MyD88与TLR(Toll receptor)相互作用的原理奠定基础。通过结构域分析、模板相似性搜索和序列比对、初始建模、精修和动力学优化,立体化学结构和能量合理性评估,获得未知三维结构的鸡MyD88-TIR三维模型。结果表明,鸡MyD88包含DEATH和TIR两个结构域,所模拟的MyD88-TIR三维模型二面角构象和氨基酸能量分布以及主侧链立体化学特性合理。     

TLR/MyD88信号通路与自身免疫性疾病

Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是近年来发现的一类模式识别受体,通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),激活天然免疫.TLR信号还通过上调抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)表面共刺激分子及APC分泌的炎症细胞因子调节获得性免疫.TLR/MyD88信号在自身免疫性疾病的发病过程中起重要作用.本文介绍了TLR/MYD88信号通路及其在自身免疫病如实验性自身免疫脑脊髓膜炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性葡萄膜炎、实验性自身免疫性心肌炎和自身免疫性肾小球肾炎等发生发展中的作用.     

病原真菌感染与TOLL样受体

TOLL样受体(TLR)是参与天然免疫的主要模式识别受体之一,与许多微生物病原体及其产物的病原相关分子模式PAMP结合后通过MyD88依赖性或非依赖性途径启动宿主胞内信号传导途径,引发一系列生物学效应。白色念珠菌表面的特征性糖磷脂甘露聚糖可被TLR2、TLR4识别,诱导前炎性细胞因子的释放及促进中性粒细胞的聚集等来介导宿主的抗真菌免疫反应。烟曲霉则可能利用表型转换(酵母样与菌丝态),通过不同TLRs逃避宿主天然免疫系统的识别。新型隐球菌的多糖荚膜成分葡糖醛氧化甘露聚糖GXM可与TLR2、TLR4、CD14结合,在单核细胞、巨噬细胞对GXM的内化、吞噬中起重要作用,而不是诱导细胞因子的分泌;酿酒酵母胞壁成分酵母多糖则可激活TLR2、TLR6异源二聚体。总之,TLR与真菌配体相互作用的具体机制及其活化后胞内信号传导调控机制的深入研究与分析,对临床真菌病的免疫调节及治疗具有重要意义。     

胰腺癌上调因子在卵巢癌中水平变化及其与TLR4/MyD88通路的关系

该文探讨了胰腺癌上调因子(PAUF)在卵巢癌中的表达水平,及其与TLR4/MyD88信号通路在卵巢癌中的关系。选取2014年10月至2016年5月在我院就诊的卵巢癌患者共217例,纳入卵巢癌组,另随机选取同期诊断为卵巢良性肿瘤的45例患者纳入卵巢良性肿瘤组和52例健康人群纳入对照组。采用免疫组织化学染色法检测受试者卵巢组织中的PAUF、TLR4和MyD88表达水平。比较三组PAUF、TLR4和MyD88的表达水平;分析PAUF和TLR4、MyD88之间存在的相关性;分析卵巢癌患者中影响PAUF、TLR4和MyD88表达水平的因素。结果显示,卵巢癌患者组织中的PAUF、TLR4和MyD88水平均显著高于良性肿瘤组和对照组(P0.05);卵巢癌组织中PAUF与TLR4表达水平呈正相关(r=0.521,P0.001),且PAUF与MyD88表达也成正相关(r=0.581, P0.001);卵巢癌组织PAUF水平与肿瘤种类、FIGO分期和肿瘤分化程度有关(P0.05),但与患者年龄无关(P0.05);而癌组织中TLR4水平只与肿瘤的分化程度有关(P0.05), MyD88表达水平只与癌症种类有关(P0.05)。由此说明,卵巢癌患者组织中的PAUF表达水平显著升高,与TLR4和MyD88表达成正相关。PAUF可能通过参与TLR4/MyD88信号通路,参与了卵巢癌的发生发展。     

Toll样受体及其信号转导

Toll样受体(TLR)介导着绝大部分哺乳动物、昆虫及植物的宿主防御. TLR4与配体结合涉及膜抗原CD14和分泌蛋白MD-2的调节并一起形成受体复合物, 然后与接头分子MyD88结合, 使IRAK磷酸化, 再使TRAF6寡聚化, 随后激活控制着各种效应基因表达的转录因子NF-κB.     

以MyD88 TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型的建立

MyD88是IL-1R/TLR受体超家族向细胞内转导胞外信号时募集到受体胞浆尾部的重要接头蛋白．由TIR结构域介导的MyD88分子同源二聚化是它招募到受体胞浆尾部的前提,然后二聚化的MyD88再募集下游信号分子,传递信号,引发促炎基因的表达．本研究旨在建立一种模型,以实现活细胞原位的、基于荧光信号变化的MyD88二聚化抑制物的高通量筛选．我们分别构建了MyD88 TIR与GFP和RFP的融合蛋白表达质粒,瞬时转染HeLa细胞,在488 nm激发光下,转染GFP-MyD88 TIR和RFP-MyD88 TIR细胞,检测到绿色荧光与红色荧光间的共振能量转移(FRET)．而当细胞转染GFP-MyD88 TIR和RFP或RFP-MyD88 TIR和GFP,因TIR二聚化不能实现,FRET效率受到严重影响．实验结果提示,依赖双阳性表达GFP-MyD88 TIR和RFP-MyD88 TIR的细胞株,检测不同化合物对于荧光FRET效率的影响,可以建立MyD88 TIR二聚化抑制药物的筛选模型．此外,我们构建了原核表达质粒,利用纯化的His-MyD88 TIR分别与GST或GST-MyD88 TIR蛋白进行体外结合实验,发现GST-MyD88 TIR(而非GST)可以与His-MyD88 TIR相互结合．结果的差异性提示,利用His-MyD88 TIR和GST-MyD88 TIR体外结合实验分析,可以进一步确定抑制物是否直接阻断了TIR的相互作用．结合真核细胞的荧光FRET阻断结果和原核表达的重组蛋白相互作用分析,可确定MyD88 TIR二聚化的抑制物．利用这一模型可以对商品化的小分子库、自行制备的天然产物组分进行广泛的筛选,从中获得有效抑制MyD88二聚化的化合物,参与对MyD88信号通路依赖的慢性炎症、自身免疫性疾病的药物治疗．     

饲料中添加椭圆栅藻对异育银鲫中科5号越冬后抗病力的影响

为探究饲料中添加椭圆栅藻(Scenedesmus ovalternus)是否可以提高越冬期异育银鲫中科5号(Carassius gibelio var. CASⅤ)的免疫力和抗病力, 实验在异育银鲫中科5号[初重(109.24±0.23) g]越冬前期(4周)投喂基础饲料或者添加4%椭圆栅藻的饲料, 并在越冬结束后用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行攻毒实验, 测定其生长、免疫力和抗病力等指标。结果表明在饲料中添加4%椭圆栅藻对中科5号的生长和攻毒后累计存活率无显著性影响(P>0.05)。髓过氧化物酶(MPO)活力在不同饲料处理中无显著性差异, 但是栅藻组在攻毒后MPO活力显著升高(P<0.05)。在嗜水气单胞菌攻毒后, 中科5号头肾中髓样分化因子88(MyD88)基因表达显著升高, 且栅藻组高于对照组(P<0.05)。此外, 摄食栅藻饲料的中科5号的Toll样受体4(TLR4)、包含Toll/白介素1的接头蛋白(TIRAP)和包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白(TRIF)基因表达也显著升高(P<0.05), 而对照组中无显著性变化(P>0.05)。因此, 中科5号摄食栅藻后MyD88依赖性或者MyD88非依赖性介导TLR信号通路可能都被激活以抵御病菌的入侵。综上所述, 在饲料中添加4%栅藻可以在一定程度上提高越冬后中科5号的抗病力, 可能是通过TLR通路进行调控。     

人髓样分化因子88的生物信息学分析

人髓样分化因子88(MyD88)属于Toll样受体和IL-1受体家族成员下游的炎症信号通路的中心因子。为了研究人MyD88的蛋白结构和功能,本文利用重要数据库进行了生物信息学分析。研究表明,人MyD88基因全长为5 670 bp,位于染色体3p22. 2,共编码296个氨基酸。人MyD88蛋白具有较高的保守性,其等电点为5. 64,不存在信号肽,并且含有2个苏木化位点、15个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点。该蛋白主要定位在细胞核和细胞质中,而且在血液、脾脏和肺较多,其二级结构含有145个α-螺旋和30个β-折叠,拉曼图表明三级结构模型A是可信的。与人MyD88相互作用的蛋白主要是Toll样受体和白介素相关蛋白,并且参与炎症反应、细胞凋亡等重要的免疫过程。本研究为阐明人MyD88基因结构特点和生物学功能奠定了理论基础,也为其相关疾病诊断和治疗提供了新思路。     

布地奈德混悬液对哮喘模型小鼠肺组织TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响

摘要 目的：探究布地奈德混悬液对哮喘模型小鼠肺组织TOLL样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）/核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）通路的影响。方法：使用4 %鸡蛋清白蛋白与2 %的Al（OH3）共同致敏小鼠,建立咳嗽变异性哮喘小鼠模型40只,将模型大鼠分别使用低、中、高剂量（0.2、1.0、2.0 g/kg）布地奈德混悬液和孟鲁司特钠进行干预,1次/日连续干预14 d,于干预14 d时采集小鼠的支气管肺泡灌注液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）、气管及肺组织,对各组BALF中的白细胞（white blood cell,WBC）、嗜酸性粒细胞、血清γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,Il-1β）、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平差异开展比较,对各组小鼠肺组织黏膜上皮增生程度评分、炎症细胞浸润程度评分、病变总评分差异,以及TLR4、MyD88、p65蛋白表达差异进行分析。结果：分析显示,布地奈德混悬液能够显著降低哮喘模型小鼠BALF中白细胞及嗜酸性粒细胞数量,同时还能够改善小鼠气管和支气管黏膜上皮增生与肺组织炎症细胞浸润状态,且干预后小鼠肺组织中的TLR4、MyD88、p65蛋白表达水平出现了明显的降低。结论：布地奈德混悬液对改善小鼠哮喘效果较好,其作用机制可能与该药能够调节TLR4、MyD88、p65蛋白表达,进而影响炎症和免疫反应进程有关。     

胰腺癌患者循环肿瘤细胞及TLR4、TLR9、myd88的表达水平与其化疗效果及转移、复发的关系

目的:探讨胰腺癌患者循环肿瘤细胞(CTC)中Toll样受体4(TLR4)、Toll样受体9(TLR9)、髓样分化因子88(myd88)的表达水平与患者化疗效果及转移、复发的关系。方法:将我院2015年6月-2016年6月收治并确诊的48例胰腺癌患者作为试验组,收集患者循环肿瘤细胞(CTC),检测其TLR4、TLR9、myd88信号表达情况,探讨其TLR4、TLR9、myd88信号表达水平与患者化疗效果及转移、复发的关系。结果:48例胰腺癌患者检出CTC 35例,检出率为72.9%。胰腺癌死亡、转移、复发患者TLR4、TLR9、myd88表达水平分别高于其存活、未转移、未复发患者,组间具有统计学差异(P0.05)。胰腺癌化疗效果CR患者TLR4、TLR9、myd88表达水平显著低于其化疗效果PR、SD、PD患者,且四组间差异具有统计学意义(P0.05);TLR4、TLR9、myd88表达水平与被膜受侵犯、淋巴结转移、肿瘤大小、CA199水平呈正相关(P0.05)。结论:胰腺癌患者CTC中TLRs/myd88信号表达水平与患者化疗效果及转移、复发密切相关。     

TLR4 对人骨骼肌细胞炎症因子表达及胰岛素抵抗的影响

目的:研究TLR4对脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)作用下的人骨骼肌细胞的炎症因子表达的影响及其在细胞胰岛素抵抗中的作用。方法:通过脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)干预骨骼肌细胞24h,再用胰岛素刺激1h后,Real-time PCR检测检测骨骼肌细胞TLR4、MyD88、TNF-αmRNA的表达;Western blot检测TLR4,Myd88和CRP的表达;葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)检测细胞培养液中葡萄糖浓度。结果:TLR4高表达可以使炎症因子的表达增高,细胞培养液中的葡萄糖浓度增高;TLR4低表达可使炎症因子的表达降低,细胞培养液中的葡萄糖浓度没有明显变化。结论:TLR4调控了炎症因子的表达,继而可以引起胰岛素敏感性的改变,影响了胰岛素抵抗的发生。     

基于响应面法优化牛蒡子多糖提取工艺及对细胞抗炎作用研究

为了确定提取牛蒡子多糖的最佳工艺条件,并探究其抗炎作用。通过响应面法考察不同料液比,提取时间和提取温度对牛蒡子多糖提取率的影响;使用ELISA试剂盒测定不同RAW 264.7细胞处理组肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的水平;经Western blot法检测髓样分化因子88(MyD88)、Toll样受体4(TLR4)和核转录因子-κB(NF-κB)的蛋白表达水平。结果显示牛蒡子多糖最优提取工艺条件为料液比1∶15(g/mL)、提取时间3 h、提取温度80℃,此时提取率为7.19%;牛蒡子多糖组对TNF-α和IL-6的分泌均有抑制作用并通过调控相关通路上的蛋白表达,起到免疫调控作用。该研究可为牛蒡子新药用成分的开发和应用奠定基础。     

氧化苦参碱下调免疫细胞TLR7mRNA的表达

为了探讨氧化苦参碱对免疫细胞Toll-like receptor7( TLR7) mRNA表达的影响,使用CCK-8试剂盒检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞的生长抑制作用.应用荧光定量PCR方法检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞TLR7 mRNA及其下游因子TNF-α mRNA表达的影响;检测氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞TLR7 mRNA及其下游因子MyD88、TRAF-6 mRNA表达的影响.结果显示,氧化苦参碱对RAW264.7细胞的半数抑制率为5.9 mg/mL.氧化苦参碱下调RAW264.7细胞TLR7、TNF-α mRNA表达;下调小鼠脾脏淋巴细胞TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA表达.由此得出,氧化苦参碱可下调免疫细胞TLR7mRNA的表达.     

Toll样受体2与巨噬细胞极化在胰岛素抵抗中的作用

胰岛素由胰岛β细胞分泌,经胰岛素信号通路发挥作用。当机体肥胖或其他原因导致胰岛素信号通路受阻时,引起体内胰岛素抵抗(insulin resistance, IR),胰岛素抵抗与低度炎症关系密切。促炎因子,例如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等可抑制胰岛素受体底物(insulin receptor substrate, IRS)酪氨酸磷酸化,发生丝氨酸磷酸化,导致胰岛素受体细胞或靶器官对葡萄糖的摄取和利用下降。Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2)是一种重要的模式识别受体,可与TLR1或TLR6结合形成二聚体,与炎症和胰岛素信号通路关系密切,TLR2通过髓系分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依赖途径激活核因子-κB(nuclear factor, NF-κB)和激活蛋白1(activator protein 1, AP-1),上调促炎基因的转录。巨噬细胞是天然免疫系统中重要一员,可参于体内促炎因子和抗炎因子的调节。TLR2于巨噬细胞表面表达。在脂肪酸(fatty acids)的诱导下,TLR2通过上调促炎基因使巨噬细胞向M1表型极化,M1表型巨噬细胞分泌促炎因子,下调胰岛素靶器官对胰岛素的敏感性。本文拟对TLR2基因和巨噬细胞极化对胰岛素抵抗的影响,以及三者的相关性做一简要综述,从分子水平探讨胰岛素抵抗的发生机制,为胰岛素抵抗的相关研究提供理论参考。     

内毒素耐受性与TLR4信号通路

内毒素(lipopolysaccharide,LPS)耐受性普遍存在,并与其他病原微生物致病因子(LAM、STF等)存在交叉耐受性。不同种类LPS产生耐受性的可能性与机制不同。TLR4作为LPS靶细胞膜上的跨膜受体,主要介导LPS信号的跨膜转导,TLR4结构与功能的改变,以及TLR4信号通路中各个环节(MD2、MyD88、IRAK、IκB、NF—κB、炎症因子)的功能缺陷,都将导致LPS耐受性的产生。