广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用受体TLR4和TLR2的影响

确定广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用受体,探索广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫调节机制。采用MTT法测定不同浓度广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响,筛选出促进巨噬细胞增殖能力最强的浓度。用筛选出的β-D-葡聚糖浓度作用巨噬细胞RAW264.7;TLR4抗体和TLR2抗体分别作用巨噬细胞RAW264.7 1h,再用含有β-D-葡聚糖的细胞培养液培养。收集细胞培养上清和细胞,检测细胞培养上清中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量;提取细胞内总RNA,采用RT-PCR测定巨噬细胞TLR4 mRNA表达量;提取巨噬细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹western blot测定TLR4的蛋白表达。广叶绣球菌β-D-葡聚糖能够促进巨噬细胞RAW264.7增殖,增加NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量,提高TLR4 mRNA表达和蛋白表达,差异极显著（P<0.01）。TLR4抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量明显下降,差异极显著（P<0.01）。TLR2抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量下降,但差异不显著。广叶绣球菌β-D-葡聚糖可以通过细胞表面受体TLR4激活信号转导通路,增强下游细胞因子的释放,从而调节巨噬细胞RAW264.7的免疫功能。TLR2可能不是广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫受体。     

Fucoidan对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

目的观察褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)对巨噬细胞RAW264.7体外吞噬活性、细胞因子TNF-α和IL-6分泌,以及Toll样受体4(TLR4)mRNA表达的影响。方法实验分对照组,Fucoidan高、中、低剂量组(浓度分别是200、400和800μg/mL)。药物处理6~48h后,MTT法检测RAW264.7细胞活力;中性红比色法检测细胞吞噬活性;ELISA法检测培养上清中TNF-α和IL-6的分泌水平;实时定量PCR检测Toll样受体4(TLR4)mRNA表达量。结果与对照组相比,Fucoidan显著增强RAW264.7细胞代谢活力和吞噬能力(P0.01),增加TNF-α和IL-6的分泌,上调TLR4的表达,呈剂量依赖关系。结论 Fucoidan可上调TLR4表达,增强巨噬细胞代谢和吞噬活性,增加TNF-α和IL-6的分泌,具有潜在的调节免疫作用。     

黄芩苷对实验性结肠炎小鼠TLRs/MyD88通路的作用研究

本文研究黄芩苷对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型的疗效,并从TLRs/MyD88通路探讨其作用机制。C57BL/6小鼠24只,分为空白对照组、模型组和黄芩苷组,用3.5%DSS诱导结肠炎模型,黄芩苷(30 mg/kg)干预7天,记录小鼠的疾病活动指数(DAI)评分,HE染色观察病理改变并评分,检测结肠髓过氧化物酶(MPO)活性,ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素(IL)-6浓度,Real-time PCR法检测TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达水平。结果显示黄芩苷能有效抑制结肠炎小鼠DAI评分、结肠组织病理学评分和MPO活性,降低IL-6和TNF-α表达,降低TLR2、TLR4和MyD88 mRNA的表达。表明黄芩苷能有效缓解DSS诱导的结肠炎小鼠模型的症状,降低炎症反应,其作用机制可能是与TLRs/MyD88通路相关。     

斗米虫蛋白体外抗肿瘤活性及其对小鼠巨噬细胞免疫调节作用

该文主要为了研究斗米虫蛋白的体外抗肿瘤活性及其免疫调节作用。提取斗米虫总蛋白,逐级盐析分为3个部分,透析除盐后得到不同蛋白部位,并采用SDS-PAGE检测斗米虫不同蛋白部位的分子量;利用MTT法、流式细胞术等方法研究斗米虫蛋白对人胃癌细胞MFC和小鼠乳腺癌细胞4T1增殖、迁移和凋亡的作用。MTT法研究斗米虫蛋白对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和人脐静脉内皮细胞HUEVC增殖的影响;荧光微球吞噬实验检测斗米虫蛋白对RAW264.7细胞吞噬能力的影响;Griess法检测对RAW264.7细胞释放NO能力的影响;ELISA法检测对RAW264.7细胞的IL-6、TNF-α和IL-1β分泌量;RT-PCR法检测不同浓度的斗米虫蛋白作用后RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ、TRL-4、IL-6以及4T1细胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1 mRNA水平变化。结果显示,斗米虫蛋白主要分子量集中于63 kDa,斗米虫蛋白对人胃癌细胞MFC及小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖表现出较好抑制作用,并呈现出一定剂量依赖关系(P<0.05),对HUEVC细胞没有细胞毒性,对RAW264.7细胞表现出较好的促进增殖的作用(P<0.05)。斗米虫蛋白实验组与正常组细胞相比可以抑制4T1细胞的迁移(P<0.01),可诱导MFC和4T1细胞凋亡(P<0.05);斗米虫蛋白能够提高RAW264.7细胞的吞噬活性、NO释放量、TNF-α、1L-1β和IL-6分泌量及TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ和IL-6细胞因子的mRNA水平以及能显著下调4T1细胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1 mRNA水平(P<0.05,P<0.01)。由此推论,斗米虫蛋白具有较好的体外抗肿瘤活性并且具有潜在的免疫调节作用。     

黄芩苷对脂多糖诱导的巨噬细胞NF-κB活化和炎症因子表达的影响

目的:研究黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表达的影响.方法:分别用LPS(终浓度1μgomL-1)和LPs+黄芩苷(终浓度10,50,100μmol moloL-1)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,用RT-PCR法和Elisa法检测细胞及其上清液中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达变化,用Western Blot法检测细胞核内NF-κB p65蛋白含量变化.结果:LPS刺激RAW264.7细胞可导致NF-κB激活,上调TNF-α、IL-6表达;黄芩苷预处理能降低LPS诱导的NF-κB出活化和TNF-α、IL-6表达.结论:黄芩苷可通过抑制NF-κB活化,下调LPS诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-6的生成,发挥抗炎作用.这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一.     

红毛五加多糖单一组分AHP-Ⅲ对巨噬细胞的免疫调节作用及其机制

探讨红毛五加多糖(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharide)单一组分AHP-Ⅲ(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharideⅢ)对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的激活作用及机制。不同浓度AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞,中性红试验检测细胞吞噬能力;ELISA和Griess法检测其IL-6、TNF-α和NO的释放量;RT-qPCR检测iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平;Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化水平。在实验浓度范围内,AHP-Ⅲ可显著增强RAW 264.7细胞的吞噬能力(P<0.05);促进RAW 264.7分泌NO、TNF-α和IL-6(P<0.05或P<0.001);并显著增加RAW 264.7细胞中IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达量,呈剂量依赖性;Western blot结果表明,AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞后,NF-κB中的p65、IKKβ、IκBα磷酸化水平明显升高。结果显示红毛五加多糖AHP-Ⅲ对小鼠巨噬细胞RAW 264.7具有显著激活作用。     

TLR4 对人骨骼肌细胞炎症因子表达及胰岛素抵抗的影响

目的:研究TLR4对脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)作用下的人骨骼肌细胞的炎症因子表达的影响及其在细胞胰岛素抵抗中的作用。方法:通过脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)干预骨骼肌细胞24h,再用胰岛素刺激1h后,Real-time PCR检测检测骨骼肌细胞TLR4、MyD88、TNF-αmRNA的表达;Western blot检测TLR4,Myd88和CRP的表达;葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)检测细胞培养液中葡萄糖浓度。结果:TLR4高表达可以使炎症因子的表达增高,细胞培养液中的葡萄糖浓度增高;TLR4低表达可使炎症因子的表达降低,细胞培养液中的葡萄糖浓度没有明显变化。结论:TLR4调控了炎症因子的表达,继而可以引起胰岛素敏感性的改变,影响了胰岛素抵抗的发生。     

EV-A71感染小鼠巨噬细胞诱导促炎细胞因子和趋化因子反应

为初步探索EV-A71在小鼠巨噬细胞中的复制情况和抗病毒的固有免疫应答,本文以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,通过建立EV-A71绝对定量qPCR方法检测EV-A71病毒载量;EV-A71和紫外灭活的EV-A71感染RAW264.7,不同时间点提取总RNA,RT-qPCR检测促炎细胞因子、趋化因子和模式识别受体的mRNA表达变化水平。本研究成功建立了EV-A71的绝对定量qPCR检测方法,并发现EV-A71感染RAW264.7后随着感染时间的延长,EV-A71病毒载量呈递减趋势;EV-A71和紫外灭活的EV-A71可以引起IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子和IP-10、MCP-1、MIP-1α趋化因子反应,上调TLR2、TLR1、TLR6、MDA5和RIG-I mRNA表达。研究结果显示,EV-A71在小鼠巨噬细胞中具有较低水平的复制,同时产生促炎细胞因子和趋化因子反应。     

大鼠海马神经元TLR4介导的MyD88依赖途径在神经炎症中的作用

目的:研究大鼠海马神经元是否有Toll样受体4(TLR4)介导的的髓样分化因子88(MyD88)依赖途径及该途径的激活在神经炎症中的作用。方法:采用体外培养7 d的新生大鼠海马神经元,细胞免疫荧光双标法鉴定海马神经元纯度。用TLR4配体脂多糖(LPS)或TLR4抗体预处理海马神经元,以激活或阻断TLR4的作用。实时定量PCR(RT-qPCR)方法检测海马神经元中MyD88、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)mRNA的表达;Westernblot方法测定海马神经元MyD88和TRAF6蛋白水平;细胞免疫荧光双标法观察海马神经元中核因子κB/P65(NF-κB/P65)的表达定位及TLR4激活或阻断后NF-κB/P65核易位情况;ELISA检测培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和一氧化氮(NO)的水平。结果:LPS能上调海马神经元MyD88和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)mRNA水平;促使NF-κB/P65转位至核;增加MyD88和TRAF6蛋白的表达;增加海马神经元培养上清中TNF-α、IL-1β和NO含量;TLR4抗体预处理能减弱LPS对海马神经元NF-κB/P65核易位作用及降低培养上清中TNF-α、IL-1β和NO的水平。结论:大鼠海马神经元有TLR4介导的的MyD88依赖途径,该途径的激活能导致TNF-α、IL-lβ和NO含量的增加。海马神经元TLR4介导的MyD88依赖途径参与了神经炎症反应,神经元不是神经炎症反应中的被动者。     

肠球菌溶血及非溶血菌株对小鼠巨噬细胞表达TNF-a的影响

【目的】探讨肠球菌溶血菌株及非溶血菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7表达TNF-а的影响。【方法】用多粘菌素B抑制排除内毒素污染对实验的影响。肠球菌溶血菌株、非溶血菌株各11株,以菌/细胞比 30∶1 感染RAW264.7细胞1 h,加入200 mg/mL氨苄青霉素继续培养24 h,分别于感染后3、6、9、24 h,用ELISA方法检测不同观测点细胞培养液中肿瘤坏死因子TNF-a的含量,并用逆转录-聚合酶链反应方法（RT-PCR）比较肠球菌溶血、非溶血菌株感染6 h后TNF-a mRNA表达的差异。【结果】未感染的RAW264.7细胞培养液中检测不到TNF-a。肠球菌溶血株感染组细胞培养上清液中各观测点的TNF-a的平均含量 (pg/mL) 均比非溶血株性组高。经t检验,P<0.01,差别有显著性。RT-PCR法检测其mRNA的表达也有相同结果：TNF-a mRNA在肠球菌溶血株感染细胞中的相对表达量比非溶血株感染的细胞高,经t检验,P<0.05,差别有统计学意义。【结论】肠球菌溶血株比非溶血株更能促进小鼠巨噬细胞RAW264.7产生TNF-а炎症因子。