金黄色葡萄球菌LDH多克隆抗体制备及其交叉反应性

目的:在原核载体中表达、纯化金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶,免疫小鼠获得多克隆抗体,使用多克隆抗体分析与其它菌种的交叉反应性。方法:复苏p ET28a-ldh/Bl21重组菌,IPTG诱导重组融合蛋白表达、以抗HIS标签的单克隆抗体进行western-blot鉴定重组蛋白。使用纯化的重组蛋白以及相应的佐剂免疫小鼠,利用ELISA测定血清抗体效价,并使用小鼠抗血清进行免疫印迹法鉴定重组蛋白的反应原性及其与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌的交叉反应性。结果:SDS-PAGE电泳在39 KDa处可见目的条带,免疫印迹法验证了重组LDH的表达,纯化后获得2.8 mg重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性Ig G效价为1:50000,western-blot鉴定显示所制备的多克隆抗血清能分别识别金黄色葡萄球菌重组及天然乳酸脱氢酶,但不识别表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌中天然乳酸脱氢酶。结论:纯化的LDH具有良好的免疫活性,免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。使用多克隆抗体western-blot显示与其它菌种LDH不存在交叉反应性,为后续使用该重组蛋白进行金黄色葡萄球菌感染的诊断研究奠定基础。     

大豆皂苷对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的：观察大豆皂苷（soyasaponins,SS）对荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法：建立S180荷瘤小鼠模型,随机分为模型对照组、环磷酰胺组（CTX）组（20mg／kg）、SS低、中、高剂量组（10、20、30mg／kg）,每组12只。连续给药15天后处死小鼠,测量小鼠免疫器官指数、淋巴细胞转化率（采用MTT法）、溶血空斑数（采用Jeme改良玻片法）、巨噬细胞吞噬功能（采用半体内法）以及NK细胞活性（采用乳酸脱氢酶法）。结果：SS中、高剂量组提高小鼠脾脏指数、脾淋巴细胞转化率、溶血空斑数、巨噬细胞吞噬率及吞噬指数、NK细胞活性,与模型对照组比较有显著性差异（P〈0．05）。与模型对照组比较,SS各剂量组胸腺指数无明显差异（P〉0．05）。结论：一定剂量的SS具有增强荷瘤小鼠免疫功能的作用,从而发挥抗肿瘤作用。     

干酪乳杆菌LC2W细胞壁组分对RAW264．7巨噬细胞吞噬活性的影响

目的探讨干酪乳杆菌LC2W细胞壁组分体外对小鼠巨噬细胞功能的影响。方法以培养液单纯培养小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞作为对照,研究干酪乳杆菌LC2W细胞壁主要组分磷壁酸和肽聚糖对RAW264．7细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性、吞噬中性红和致病菌能力的影响。结果不同浓度磷壁酸和肽聚糖对小鼠巨噬细胞RAW264．7细胞LDH活性、吞噬中性红能力有明显增强作用,并呈一定的剂量效应。在相同质量浓度时,2种细胞壁组分刺激RAW264．7细胞吞噬中性红能力差异无显著性,但磷壁酸对巨噬细胞RAW264．7细胞内LDH活性的增强作用高于肽聚糖。在受到浓度为50μg/ml的磷壁酸和肽聚糖刺激后,磷壁酸和肽聚糖均能显著增强RAW264．7对致病性大肠埃希菌和肠炎沙门菌的吞噬作用（P〈0．01）。经过刺激的巨噬细胞与致病菌共孵育1h后,其吞噬能力达到最大值。结论干酪乳杆菌LC2W细胞壁主要组分磷壁酸和肽聚糖可以增强小鼠巨噬细胞RAW264．7细胞内LDH活性及吞噬能力,并具有剂量效应。     

真菌多糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

利用筛选的9383多糖、944、945三种多糖提取液按一定比例注入小鼠腔,能明显提高巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数,与对照组相比,前者增加3．2—4．7倍,后者增加2．8—5．9倍,抗疲劳试验中,多糖组小鼠游泳时间比对照组平均多游20分钟,表明真菌多糖能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能增强,具有增强机体能量,强身健体之功效,是一种很好的非特异性免疫激活剂。     

神经酰胺对小鼠皮层神经元乳酸脱氢酶代谢的影响

目的研究神经酰胺对小鼠皮层神经元乳酸脱氢酶(LDH)代谢的影响。方法在培养的小鼠皮层神经元上清中分别加入50、100、200、500、1000、2000nmol/L的神经酰胺,分别作用0、1、4、8、12、16、24、36h,测定LDH浓度,计算其代谢率和漏出率。结果可显著改变乳酸脱氢酶(LDH)在细胞内外的分布,随神经酰胺作用时间的延长或剂量的增加,细胞外LDH含量显著升高,但神经酰胺对细胞总LDH代谢无影响。结论神经酰胺可增加LDH漏出率,但对细胞总LDH代谢无影响。     

磷酸鞘胺醇对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的调控及机制研究

采用Western blot、免疫荧光和PCR检测小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中S1P受体1-3(S1PR1-3)的表达,然后应用吞噬实验和免疫荧光的方法检测磷酸鞘胺醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)对其吞噬功能的调节。分别应用药理学工具和小干扰RNA的方法研究S1P调节其吞噬活性的作用机制。结果显示,小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7表达S1PR1-3;S1P剂量依赖地增强小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的吞噬功能,应用S1PR2或S1PR3的拮抗剂和si RNAs可抑制S1P增强的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的吞噬活性;而应用S1PR1的拮抗剂和si S1PR1并不影响S1P增强的RAW264.7的吞噬作用;且S1P可以显著上调RAW264.7中S1PR2和S1PR3的表达,但是不改变S1PR1的表达,提示S1P通过正反馈机制增强其介导的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的吞噬功能。结果表明,S1P/S1PR2/3信号通路增强小鼠单核巨噬细胞吞噬活性,为单核巨噬细胞吞噬作用的分子机制调控研究提供了新线索。     

蛋白质粉对小鼠免疫功能的影响

目的探讨蛋白质粉对正常小鼠免疫调节作用。方法将BALB/c小鼠随机分为3批,每批分为4组,分别进行了小鼠免疫器官/体质量比值测定和小鼠碳廓清实验;绵羊红细胞诱导小鼠DTH、抗体生成细胞检测和血清凝血素测定（HC50）;ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和乳酸锂脱氢酶法（LDH）测定NK细胞活性;小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。结果10.00 g/kg剂量的蛋白质粉可增强绵羊红细胞诱导小鼠DTH能力（P〈0.05）,促进抗体生成细胞数的生成（P〈0.01）。3.33 g/kg和10.00 g/kg剂量组能促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力（P〈0.05或P〈0.01）和血清凝血素的生成（P〈0.05）;三个剂量组均能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力（P〈0.05或P〈0.01）;3.33 g/kg和10.00 g/kg剂量组能提高NK细胞活性（P〈0.05）;但对小鼠碳廓清能力和免疫器官/体重比值无明显影响。结论蛋白质粉对正常小鼠的细胞、体液免疫和单核-巨噬细胞功能和NK功能有促进作用,即具有增强免疫力功能。     

海金沙提取物体外抑菌性能研究

用M／C和纸片法考查了海金沙提取物对藤黄球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的抑菌性能。结果表明：海金沙对4种受试菌株都有抑菌活性;37℃时,醇提物对乙型溶血性链球菌的抑菌效果最好,最大抑菌圈为8．5mm;42℃时,对藤黄球菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌效果最好,最大抑菌圈分别为21、13．2和6．5mm。pH值为7．6时,海金沙醇提物在对藤黄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和乙型溶血性链球菌的最大抑菌圈分别为9．1、8．2、9mm和11．3mm。海金沙水提物和醇提物对藤黄球菌、乙型溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量分数分别为25％、12．5％、12．5％、25％和3．12％、1．56％、6．25％、3．12％．     

海胆黄多糖SEP对S180的体内抑制作用

研究海胆黄多糖SEP对S180肉瘤的抑制作用及初步机制。MTT法检测SEP对体外培养的S180细胞生长的抑制作用;建立小鼠S180肉瘤模型观察SEP抗肿瘤活性;检测SEP协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用;同时,考察SEP对NK细胞和杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lym-phocyte,CTL)活性的影响;碳粒廓清检测SEP对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响。研究表明,海胆黄多糖SEP高中低剂量(16、8、4 mg/kg)显著抑制小鼠180实体瘤生长,增加小鼠脾指数和胸腺指数,协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,提高小鼠NK细胞和CTL活性,增强小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能,通过免疫调节提高小鼠免疫功能达到抑制S180作用。     

噬菌蛭弧菌代谢产物活性成分对小鼠免疫功能的影响

目的研究噬菌蛭弧菌代谢产物活性成分对小鼠免疫功能的影响。方法将噬菌蛭弧菌代谢产物的3种有机溶剂（石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯）提取物和提取后的剩余液体分别腹腔注射实验小鼠,分两次注射,共注射0.5 mL,注射后连续饲养28 d,每隔7 d小鼠采血检测离体白细胞吞噬活性（phagocytic activity）、吞噬细胞杀菌活性（bactericidal activity）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、血清凝集抗体效价、血红蛋白值和红细胞数的变化,以研究不同提取物对小鼠免疫功能的影响。结果石油醚提取物组和三氯甲烷提取物组小鼠血清SOD活性、血清凝集抗体效价、离体白细胞吞噬活性和吞噬细胞杀菌活性增强与对照组相比差异极显著（P〈0.01）;乙酸乙酯提取物组SOD活性和血清凝集抗体效价增强与对照组相比差异极显著（P〈0.01）,离体白细胞吞噬活性和吞噬细胞杀菌活性增强与对照组相比差异显著（P〈0.05）;石油醚提取物组的血红蛋白值（12.64 g/100 mL）和红细胞数（11.32×106/mL）最高。各项指标的峰值均出现在第7天~第21天。结论噬菌蛭弧菌代谢产物3种有机溶剂提取的活性物质具有增强小鼠免疫功能的作用。     

甘草提取物的抑菌作用及其对小鼠免疫功能的影响

目的 研究甘草提取物的最低抑菌浓度及其对小鼠免疫功能的影响.方法 以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为供试菌.结果 甘草提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为12 mg/mL.甘草提取物能提高小鼠的免疫功能,当甘草提取物浓度为100μg/mL时,与对照组相比,小鼠脾脏T淋巴细胞增殖率为(32.62±1.06)％,B淋巴细胞增殖率为(28.20±1.68)％;腹腔巨噬细胞的增殖率为(40.19 ±2.38)％;腹腔巨噬细胞吞噬能力提高(24.20 ±0.01)％;NK细胞杀伤活力提高(15.83 ±1.02)％;IL-1、IL-2的体外诱生增殖率分别为(12.34±0.72)％、(23.78±1.87)％.结论 甘草提取物能抑制大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的生长,且抑制作用呈剂量依赖性.     

体外培养骨髓巨核细胞脱氢酶活性的细胞化学观察

本文采用液体培养体系结合酶细胞化学方法,对体外培养不同发育阶段的小鼠肾髓巨核细胞乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶的活性变化进行了动态观察。在9天培养期间,巨核细胞的增殖数在5—7天达到高峰,并随时间有不同程度分化。对培养3、5、7、9天的巨核细胞进行酶细胞化学研究,结果表明,巨核细胞在发育成熟前,三种酶活性均有增高。提示巨核细胞在分化过程中,糖酵解及三羧酸循环代谢均有增强。     

连翘对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及机制的试验研究

探讨连翘对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及机制。根据2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定连翘对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)。用连翘的MIC浓度的处理金黄色葡萄球菌,分别在0、4 h、8h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h取样测定光密度值(OD值),绘制其生长曲线。用MIC的连翘处理金黄色葡萄球菌24 h,检测琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性。用MIC的连翘作用于金黄色葡萄球菌,电导仪检测0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h时上清液稀释20倍的电导率,紫外分光光度计检测DNA、RNA等大分子物质的外渗水平。连翘对金黄色葡萄球菌的MIC为0.12 mg/m L。连翘作用后的金黄色葡萄球菌生长明显受到抑制并且提前4 h进入衰亡期。连翘作用后的金黄色葡萄球菌中SDH和MDH活性显著下降,而培养基上清的电导率明显升高,DNA、RNA等大分子物质外渗水平明显增多。连翘能抑制金黄色葡萄球菌的生长,作用机制可能与细胞膜通透性及SDH和MDH代谢酶活性有关。     

猪源乳酸菌产乳酸及其抑菌特性研究

研究了5株(L1、12、L3、L5和L7)分离自仔猪肠道的乳酸菌的产乳酸能力及抑菌特性。结果表明：L5菌株产乳酸的速度最快,培养液中乳酸含量最高,L5菌株培养液pH值的下降速度最快,终末pH值最低,而L1菌株产乳酸的速度最慢,培养液乳酸含量最低。5株乳酸菌对大肠杆菌K88、K99、987P、O141和大肠杆菌E1及金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用;排除酸的影响后仍有22％～53％抑菌效果;经热处理后保持有92％以上的抑菌效果;蛋白酶处理后保持85％以上的抑菌效果。     

草鱼肠道肝胰脏蛋白酶活性初步研究

对不同种类不同蛋白质水平的饲料与草鱼肠道、肝胰脏蛋白酶活性之间的关系,对草鱼前、中和后肠蛋白酶活性的差异,以及这些酶的最适酪蛋白浓度和最适pH值进行了测定研究。草鱼肠道和肝胰脏蛋白酶活性在饲料含蛋白质32—40％的范围内随着蛋白质含量的增加而升高。肝胰脏蛋白酶活性要比肠道稍高些。饲草草鱼肝胰脏蛋白酶比活为每毫克酶蛋白每分钟产生332．5微克酪氨酸,肠道蛋白酶比活为260．0微克酪氨酸。草鱼肠道蛋白酶活性以后肠较高,前、中肠次之。在pH4—9范围内,以酪蛋白作为底物,草鱼肠道、肝胰脏蛋白酶最大活性分别在pH6．5和pH7．0。在酪蛋白实际浓度为83．33—333．33微克／毫升范围内,肠道和肝胰脏蛋白酶最适酪蛋白浓度分别为166．67微克／毫升和208．33微克／毫升。     

硫酸锌(ZnSO4)对米根霉发酵产乳酸的影响

[目的]为了了解无机盐与米根霉L-乳酸代谢之间的关系,提高米根霉菌株RLC41-6发酵产L-乳酸的产率与质量,研究了ZnSO4浓度与菌株乳酸代谢和细胞内乳酸脱氢酶活性的关系.[方法]在米根霉培养基中加入不同浓度ZnSO4,经过36℃培养36 h后,应用HPLC-反相色谱法测定产物中的L-乳酸含量,并利用活性PAGE分析法测定细胞内乳酸脱氢酶的活性和组成.[结果]实验结果显示,ZnSO4对除LDH1之外的其它几条同工酶都有促进作用,尤其对LDH4,LDH5作用明显,当ZnSO4浓度大于0.02％时,LDH4,LDH5达到最大水平,同时高浓度的锌离子在体外抑制了LDH的活性.当ZnSO4浓度为0.02％时LDH酶活达到最大200 U/mL,HPLC图谱表明,此时发酵产物的只有L-乳酸,且产量达到最大137g/L,乳酸转化率为91％.[结论]Zn+会影响米根霉的乳酸代谢过程,并导致发酵过程中产物类型的变化,合适浓度的ZnSO4在米根霉代谢产乳酸的过程中,提高了乳酸脱氢酶LDH的表达,抑制丙酮酸进入苹果酸和富马酸途径,从而有利于提高葡萄糖到乳酸的代谢.     

复合益生菌粉对小鼠免疫机能的影响研究

目的：研究复合益生菌粉在增强免疫力功能方面的作用。方法：采用经口灌胃给予方式,设受试物组3组,分别为低、中、高剂量组,同时设阴性对照组（生理盐水）,从小鼠体重指标、细胞免疫、体液免疫、单核—吞噬细胞活性、NK细胞活性等方面综合评价复合益生菌对小鼠体内免疫机能的影响。结果：与空白对照组相比,中、高剂量下的益生菌粉组中的小鼠抗体生成细胞数显著增加（P<0.05）;低、中、高剂量益生菌组中的小鼠碳廓清功能显著提高（P<0.05）;高剂量组的NK细胞活性比对照组有显著性提高（P<0.01）。不同剂量的益生菌给予期间,均未见益生菌粉对小鼠体重、脾脏/体重比值、胸腺/体重比值、足趾肿胀度、淋巴细胞增殖能力、半数溶血、巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力有影响。结论：该复合益生菌粉能够增强体液免疫、单核—吞噬细胞活性和NK细胞的活性,具有一定的免疫增强功能。     

AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌,对AgNO3的抗菌效果进行研究,并对其抗菌机制作初步探讨。AgNO3对大肠杆菌的抑制生长曲线表明:2.891 mg/L的AgNO3能够完全抑制106个/mL的大肠杆菌细胞生长,AgNO3使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的延滞期加长,并且浓度越高,延滞期越长。另外,AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢酶的活性有明显影响,随着AgNO3浓度的提高,脱氢酶的活性逐渐降低。AgNO3溶液作用于细菌后,细菌表面疏水性均有不同程度地下降,且浓度越大对其影响也越明显,大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡萄球菌。     

松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的影响

目的探讨松子壳多糖（pine nut shell polysaccharide,PSP）对小鼠主要免疫细胞的影响。方法应用MTT法测定PSP对小鼠脾淋巴细胞的毒性和对ConA或LPS诱生小鼠脾T、B淋巴细胞的转化,用中性红吞噬试验测定腹腔巨噬细胞的吞噬功能,应用乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞的杀伤活性。结果 PSP对脾细胞毒性很低,各种浓度对小鼠脾淋巴细胞的增殖均有较强的促进作用（P〈0.01）;PSP在浓度50～300μg/mL时,明显促进T淋巴细胞的转化（P〈0.01）,但是当浓度达到300μg/mL时表现出一定的抑制作用（P〉0.05）;PSP在25～200μg/mL时显著促进了小鼠脾B淋巴细胞的转化（P〈0.05）,但是当浓度达到300μg/mL时,抑制作用极显著（P〈0.01）;不同浓度均可以增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力及其代谢功能,当浓度在100μg/mL时能显著的促进巨噬细胞吞噬中性红的能力（P〈0.01）;PSP在浓度100～300μg/mL时,能极显著的促进NK细胞对Yac-1的杀伤作用（P〈0.01）,当浓度达到400μg/mL,对NK细胞杀伤性的促进作用开始减弱。结论 PSP对小鼠脾淋巴细胞的毒性较低,能增强免疫细胞活性,有望成为新一代免疫调节剂。     

甲型流感病毒免疫治疗S_（37）腹水瘤的实验研究

用甲型流感病毒７５－３９株鼠肺适应型,免疫治疗Ｓ３７腹水瘤小鼠,存活率达９３．３％。体外流感病毒感染Ｓ３７肿瘤细胞,经不同时间观测,到３天时Ｓ３７细胞经胎盘蓝染色发现细胞１００％死亡。而对照组Ｓ３７细胞死亡率为１０％左右（ｐ＜０．０１）。进一步研究病毒免疫治疗Ｓ３７腹水瘤小鼠的机理,发现经病毒感染后小鼠ＮＫ细胞杀伤活性升高达５８％,正常鼠ＮＫ活性为２２％,两者有显著性差异（ｐ＜０．０１）。另外,检测病毒注射后小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性也随之升高。