一种体外皮肤腐蚀性试验替代方法的建立

目的建立皮肤腐蚀性的体外检测方法—大鼠经皮电阻试验(TER),优化OECD指南标准TG 430大鼠经皮电阻方法结果判定标准,并评价该方法作为替代方法用于评估化妆品原料的皮肤腐蚀性检测可行性。方法参照经合组织(OECD)化学品检测指南中TG 430体外皮肤腐蚀性大鼠经皮电阻试验的流程,使用Wistar大鼠对16种参考化学物质进行皮肤腐蚀性检测,设定不同的判定标准方案,通过对比筛选出最优的判定标准方案;并在5个实验室间进行11种参考物质的结果比对。结果改良后的TER结果判定方案结论与参考化学物质的实际腐蚀性结果具一致性(Kappa值0.64),改良方案B的特异性为66.7%,敏感性为100%,效能最高;实验室间比对结论差异无显著性(P0.05),实验室间对11种参考物质的判定一致率为72.7%。结论经改良的大鼠经皮电阻试验可较好的筛选化学物质的腐蚀性,有望在我国的替代毒理学及化学物质安全性评价中发挥重要的作用。     

紫茎泽兰醇提物的毒理学研究

为确保以紫茎泽兰提取物为主要原药的植物源农药的安全性,对紫茎泽兰醇提物进行了小鼠经口急性毒性试验、大白兔急性皮肤和眼刺激试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核计数及小鼠精子畸形试验等急性毒性和遗传毒性试验。结果表明,受试物对两种性别的小鼠经口急性毒性试验,LD50大于5000mg／kg,对大白兔皮肤无刺激性;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验及小鼠精子畸形试验结果均为阴牲,受试物未见遗传毒性。     

蜂胶提取物的安全性试验研究

目的 探讨蜂胶的乙醇提取物（EEP）的安全性。方法 用0.5％的EEP对家兔进行皮肤急性毒性试验、皮肤刺激试验以及对豚鼠的过敏试验。结果 EEP低剂量、高剂量皮肤破损组和对照组皮肤破损组各有一只家免,在24 h观察到皮肤破损处微红,48 h消失,其余各实验兔的皮肤、毛发、眼、粘膜、呼吸、中枢神经系统均无任何中毒表现;按照皮肤刺激反应强度,评价标准,完整皮肤组平均分为0,判为无刺激性;破损皮肤组平均分值为033＜0.50,亦判为无刺激性;A组空白对照组和B组EEP组动物均无红斑和水肿反应,判为无致敏性。结论 蜂胶提取物EEP在对实验动物体外寄生虫净化中安全、无毒、无刺激。     

化学腐蚀性组织工程皮肤检测模型的构建

利用组织工程学方法,以牛I型胶原为支架,人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞为细胞来源,构建化学腐蚀性检测用组织工程皮肤模型。选用欧洲替代方法验证中心(the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods,ICCVAM)制定的体外测试化学品腐蚀性最小执行标准中的8种化学品为检测物质。在检测实验中,8种化学品(固体10mg、液体25μl)分3min、1h局部接触组织工程皮肤模型表面,MTT方法测定细胞活力,相对细胞活力值作为判定腐蚀性的标准。结果表明,构建的组织工程皮肤检测模型结构完整,含有基底层、棘层、颗粒层和角质层,能准确判断7种化学品的腐蚀性。构建的组织工程皮肤模型可以作为检测工具用于化学品腐蚀性的检测。     

黑豆乳清多肽抗皮肤光老化作用的研究

以昆明小鼠为对象,研究了黑豆乳清多肽对皮肤光老化的保护作用.试验设空白组(动物不照射紫外线),阳性对照组(脱毛区皮肤涂抹10％ Vc溶液),给药大、小剂量组(分别涂乳清多肽含量为15％和5％的乳液),模型组(涂抹蒸馏水)和基质组(涂抹基质乳液).除空白组外,其余各组小鼠均用长波紫外线照射12周.试验结束后处死动物,取受试部位皮肤进行切片观察和生化指标检测.结果表明,与模型组相比,给药大剂量组动物皮肤中CAT活力水平和HYP含量均显著升高(P＜0.01)、单位面积的皮肤质量和MDA含量显著降低(P＜0.01),皮肤红斑量和受损程度明显减轻.表明黑豆乳清多肽有抗皮肤光老化的作用.     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2氯化血红素结合位点多肽对牙龈卟啉单胞菌生长抑制作用

目的探讨牙龈卟啉单胞菌血凝素2（Porphyromonas gingivalis hemagglutinin-2,PgHA-2）的氯化血红素结合位点多肽对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）摄取氯化血红素生长的影响。方法合成多肽DHYAVMISK（肽1）,DEYAVMISK（肽2,肽1中第2位氨基酸突变为谷氨酸）,ALHPDHYLI（肽3,HA-2结合位点不相关多肽）。将肽l、肽2、肽3分别与氯化血红素琼脂糖珠预孵育,加入Pg重组血凝素2（Porphyromonas gingivalis recombinant HA-2,PgrHA-2）,收集与氯化血红素结合的PgrHA-2,SDS—PAGE电泳,分析多肽对PgrHA-2与氯化血红素结合的抑制作用。肽1、肽2、肽3与氯化血红素预孵育后,加入到CDC液体培养基中培养Pg,测定菌液A600值,分析多肽对Pg生长的抑制作用。结果肽1浓度依赖性抑制PgrHA-2与氯化血红素结合,而肽2和肽3对PgrHA-2与氯化血红素的结合无抑制作用。在24、48和72h时间点,肽1组的A600值较肽2、肽3和PBS组明显降低（P〈0．05）。结论本研究表明PgHA-2氯化血红素结合位点多肽DHYAVMISK与Pg竞争结合氯化血红素,抑制Pg的生长,为开发新的牙周病防治方法奠定基础。     

人类巨细胞病毒编码US28受体拮抗性多肽的筛选鉴定及体外活性研究

立足US28的广谱趋化因子结合活性,寻找拮抗剂多肽的先导物．通过预测US28的结合模拟位设计多肽序列,合成相关多肽,再利用自建的25种趋化因子随机构成的噬菌体12肽库筛选结合模拟位,竞争性ELISA方法验证,从而获得30个阳性克隆,测序并推导氨基酸序列,得到7种序列：GSESLNAHCALW、EIDGFNAHCALL、VIARLNAHCALR、ATECLNAHCALW、VIESLNAHCALW、DNGSINAHCALL及VKKTLNAHCALR．所有序列富含疏水氨基酸,其中8个克隆有LNAHCAL保守序列．采用趋化抑制实验检测多肽对生理性趋化因子引起的细胞迁移活性的影响,流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度变化．结果表明,利用人源趋化因子序列构建肽库并筛选有效序列的方法取得成功,筛选出的阳性克隆保守序列LNAHCAL可以模拟Human MIP-1β与US28 N端的结合位,从而与合成多肽H22结合,多肽H22可以阻断受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用,本身不引起趋化运动,不影响胞内信号转导和细胞自然活性,具有广谱趋化因子拮抗剂的可能性．     

夹竹桃、鱼藤、乌桕对锈同心舟蛾的毒杀活性

为有效控制锈同心舟蛾HomocentridiapictaHampson对木荷(SchimasuperdaGardn.etChamp.)的危害,用索氏提取法获得夹竹桃(NeriumindicumMill.)叶、鱼藤(DerristrifoliateLour.)叶和乌桕(Sapiumsebiferum(L.)Roxb.)皮的乙醇提取物,在室内分别测定3种植物提取物对锈同心舟蛾3龄幼虫的防治效果。实验结果和方差分析表明,3种植物提取物为锈同心舟蛾都具有防治效果,3.5d后,受试昆虫的校正死亡率都达到60%以上;其中以夹竹桃和乌桕的提取物对受试昆虫的影响最为明显,6d后,受试昆虫的校正死亡率都达到90%以上。3种植物对锈同心舟蛾的毒杀作用由大到小的顺序依次是乌桕、夹竹桃和鱼藤。     

转基因植物中Bt杀虫蛋白的重组噬菌体辅助检测

以LRP和棉花总蛋白为本底蛋白,纯化的Bt杀虫蛋白为目标蛋白,利用噬菌体展示技术从噬菌体的随机七肽库中筛选与Bt蛋白特异性结合的七肽.ELISA检测表明经过三轮淘筛过程,特异性多肽得到了高度富集,其中PH5可与Bt蛋白特异性结合.将筛选出的PH5作为Bt蛋白的“类抗体”用于抗虫转基因植物的检测,由此建立了一种新的检测方法,讨论了噬菌体展示技术在植物基因工程中的潜在应用价值.     

Ames试验假阳性的判断方法

目的:确立一种判断Ames试验假阳性的可靠方法。方法:在Ames平皿掺入试验中发现经受试物处理的TA97和TA1535的菌落数相比溶媒对照组明显增加,为了证实其是因为受试物致突变性导致的回变菌落数增加还是由受试物毒性导致的菌落数增加,对分别经受试物和阳性对照物处理的Ames菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上,观察比较细菌的生长情况。结果:经受试物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中,而经阳性对照物处理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上,说明经受试物处理的菌株没有发生突变。结论:此方法能可靠地验证菌株是否为突变菌株,由本研究可以发现经受试物处理的菌株没有发生突变,Ames平皿掺入试验中所观察到的菌落数增加是由于受试物毒性造成的假阳性。     

转基因植物致敏性的预测方法

转基因植物的过敏性评估是转基因植物安全性评价中的重要内容,简要介绍了国际上转基因致敏性评估采用的基本策略,重点阐述了氨基酸序列同源性分析技术在致敏性评价中的应用,同时针对当前致敏性评估的局限性,讨论一种致敏性评估的新方法---预测蛋白的免疫原性。通过对两种方法的介绍,旨在说明现代生物信息学在转基因植物致敏性评估中的应用价值。     

蕨菜乙醇提取物的Ames试验研究

目的：研究蕨菜乙醇提取物的致突变作用,为蕨菜的开发利用提供一定依据;方法：制备蕨菜乙醇提取物,采用Ames试验方法,以50μg/皿敌克松作为诱变剂,分别添加提取物50、100、200、400、800μg/皿,统计回变菌落数;结果：受试物各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍,且无剂量-反应关系;结论：在本实验条件下,蕨菜乙醇提取物无致突变作用.     

杀菌肽及膜蛋白螺旋结构预测

杀菌肽是昆虫免疫系统的能够杀死细菌的一类重要的多肽。实验方法测蛋白质的二级结构很困难,汇集已有的八种预测螺旋结构的方法,通过计算机实现,对比杀菌肽、光合反应中心的预测结果和实验结果,推测了杀菌肽的作用机理．     

烟曲霉抗原Asp f16HLA-A*0201限制性的CD8+CTL抗原表位生物信息学预测与实验室鉴定

目的 预测与鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A *0201限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位.方法 以国人常见的HLA-A*0201位点为靶点,依据生物信息学软件扫描烟曲霉特异性抗原Asp f16的全部427个氨基酸序列.使用HLA-A *0201转基因小鼠制备骨髓来源的树突状细胞(DC)和CTL.流式细胞仪技术检测DC表面MHC Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c的表达来验证其是否成熟.ELISPOT试验检测烟曲霉抗原多肽特异性CTL产生的细胞因子IFN-γ.四聚体(Tetramer)试验证实烟曲霉特异性CTL与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的亲和性.结果 根据与MHC I类分子结合的半衰期评分,选择了3个HLA-A*0201限制性抗原表位.流式细胞仪分析示成熟DC高表达HLA Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c.Tetramer试验证实烟曲霉特异性T细胞受体与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的高亲和性.ELISPOT实验结果 表明烟曲霉抗原肽体外可以活化CD8+CTL,被负载了抗原肽的DC刺激活化后可以产生IFN-γ.结论 本研究成功鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型抗烟曲霉疫苗提供参考.     

药物安全性评价中豚鼠全身过敏试验方法的研究

目的在新药临床前安全性评价中对药物致敏性的研究日益受到重视。本实验基于我国新药评价指导原则,分析探讨SFDA颁布的指导原则中豚鼠全身过敏实验方案中可能影响实验结果的问题和因素。方法在GLP条件下,以体重为300～400克的豚鼠为实验对象,以牛血清白蛋白、生理盐水等受试物为对照,研究不同致敏剂量、激发剂量、激发时间、激发途径和激发次数等条件下,豚鼠全身过敏的发生情况。结果在一定剂量范围内,豚鼠全身过敏反应的发生率与致敏剂量、激发剂量和激发途径无关,但症状发生的严重程度与致敏剂量、激发剂量和激发途径有关。结论新药过敏性评价研究应参照指导原则,注意试验的剂量设计和给药途径。     

促胰岛素释放肽和GLP-1类似物研究进展

近年来,从细菌、真菌等低等生物和爬行类、哺乳类等高等动物的体内,都发现存在着结构和功能相关、相似的促胰岛素释放肽或GLP-1类似物.目前国内外研究都在密切关注胰高血糖素样肽-1(glucagonl-ikepeptide-1,G LP-1)和G LP-1类似物等胰高血糖素家族肽,对其进行基因工程高效表达或通过组合化学方法修饰、改造,从而设计治疗Ⅱ型糖尿病的多肽类药物.但是,从天然生物体内,尤其是最近从两栖类动物皮肤分泌液中和响尾蛇毒素中发现了大量能稳定促进胰岛素释放的生物活性肽,却还没有受到足够的重视,它们将很可能为筛选和开发出安全、高效、半衰期长的治疗Ⅱ型糖尿病新药物提供全新的思路和广阔的前景.     

茶活性成分对几种植物致死型病原真菌的抑制效果分析

已有研究表明茶叶对细菌和有些真菌有显著抑制作用。为探讨茶的活性物质对几种植物致死型病原真菌的抑制效果,我们购买了两种重要的茶活性物质茶皂素和绿茶提取物茶多酚,测试它们对核盘菌、镰刀菌和灰霉菌的抑菌效果。结果表明,茶皂素对3种植物致死型病原真菌的抑制效果与浓度成正比关系。绿茶提取物茶多酚对灰霉菌有明显抑制效果,但对核盘菌1980和镰刀菌PH-1仅在浓度为100 mg/m L,液体体积为100μL时有抑菌效果。同时还发现不同品种的茶叶乙醇浸提时间不同,对几种病原真菌的抑制效果不同。红茶、绿茶和乌龙茶浸提4 h、8 h、16 h的乙醇提取液对核盘菌1980都有抑制效果;8 h红茶、绿茶浸提液和16 h红茶浸提液对镰刀菌PH-1有明显抑菌效果。该研究结果为进一步在控制植物致死型病原真菌病害方面开发利用茶活性物质提供了理论依据。     

重组人干扰素α2a软膏的动物皮肤试验

目的 :观察动物皮肤接触重组人干扰素α2a软膏后所产生的刺激反应情况 ,动物完整皮肤及破损皮肤短期内接触重组人干扰素α2a软膏所产生的急性毒性反应以及通过动物皮肤重复接触重组人干扰素α2a软膏后 ,观察机体免疫系统反应在皮肤上表现。方法 :选择家兔和豚鼠为试验动物 ,将干扰素软膏涂在脱毛的动物皮肤上 ,以赋形剂为空白对照 ,2 .4—二硝基氯代苯为阳性致敏物对照。结果 :本品对皮肤的刺激强度〈0 .5 ,即重组人干扰素α2a软膏无刺激性和弱致敏性。结论 :重组人干扰素α2a软膏动物试验中未见皮肤刺激性和过敏性发生 ,说明本品具有较高的安全性     

噬菌体展示技术筛选抗轮状病毒多肽的试验研究

从噬菌体随机展示十五肽文库筛选出4个与轮状病毒粒子特异性结合多肽。经空斑减少抑制实验和MTT法分析表明其中3个多肽对病毒感染培养细胞具有抑制作用,其中序列为QSNPIHIITNTRNHP的C肽具有显著抑制作用,抑制效果达93%,另外2个多肽A和B抑制效果分别为40%与50%。经过多肽序列分析发现这3个十五肽具有2个保守序列,分别是第2至8个氨基酸残基SNPIHII和第12~15个氨基酸残基NIP。胰蛋白酶水解位点分析表明C肽无裂解位点,而A肽和B肽则分别具有3个和4个潜在水解位点。抑制病毒感染液中胰蛋白酶活性,发现A,B两肽也能显著地抑制病毒离体感染。说明所筛选的多肽2个保守序列的完整对抗病毒感染起着重要作用。C肽有望成为一种治疗轮状病毒感染的口服药物。     

B型肉毒毒素重链抗原表位的预测及表位合成肽抗原性的检测

目的:预测B型肉毒毒素蛋白抗原表位,研究表位合成肽的生物学活性。方法:利用生物信息学,结合Anthwine分析软件及网络平台,预测B型肉毒毒素蛋白重链的B细胞抗原表位。人工合成4条(P1,P2,P3,P4)表位多肽,与抗B型肉毒毒素类毒素的马血清反应;采用腹腔注射的方式用合成肽免疫BALB/c小鼠,检测免疫血清与合成肽的结合;对免疫小鼠腹腔注射B型肉毒毒素。结果:合成的多肽能与抗B型肉毒毒素的类毒素的马血清结合;多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体,其中P1、P3、P4产生的抗体对受毒素攻击的小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。