噬菌体展示技术筛选抗轮状病毒多肽的试验研究

从噬菌体随机展示十五肽文库筛选出4个与轮状病毒粒子特异性结合多肽。经空斑减少抑制实验和MTT法分析表明其中3个多肽对病毒感染培养细胞具有抑制作用,其中序列为QSNPIHIITNTRNHP的C肽具有显著抑制作用,抑制效果达93%,另外2个多肽A和B抑制效果分别为40%与50%。经过多肽序列分析发现这3个十五肽具有2个保守序列,分别是第2至8个氨基酸残基SNPIHII和第12～15个氨基酸残基NIP。胰蛋白酶水解位点分析表明C肽无裂解位点,而A肽和B肽则分别具有3个和4个潜在水解位点。抑制病毒感染液中胰蛋白酶活性,发现A,B两肽也能显著地抑制病毒离体感染。说明所筛选的多肽2个保守序列的完整对抗病毒感染起着重要作用。C肽有望成为一种治疗轮状病毒感染的口服药物。     

综述——新型纳米生物材料的研发：模板法制备羟基磷灰石纳米结构微球及其机制探讨

羟基磷灰石作为人体和动物骨骼的主要无机成分,被广泛应用于人体硬组织的修复和替换．而羟基磷灰石微球因具有比表面积大、流动性好等优点,成为生物医学领域的重要研究对象．本文重点论述了采用软/硬模板合成羟基磷灰石纳米结构微球的方法、原理,以及微球和纳米结构的形成机理．提出了羟基磷灰石纳米结构微球研究中存在的问题,并对其前景进行展望．     

一种构建马链球菌兽疫亚种血红素受体基因缺失突变株的方法

【目的】探讨一种构建马链球菌兽疫亚种基因缺失突变株的方法。【方法】PCR扩增目的基因,用pJR700温度敏感载体系统,构建目的基因载体;反向PCR扩增目的基因缺失载体片段,连接,产生目的基因缺失载体;电转化缺失重组质粒导入感受态细胞,先在37℃卡拉霉素(kan)培养基中连续培养,然后在30℃不含kan液体培养基中传代,挑取抗生素敏感菌落,PCR扩增检测抗生素敏感菌染色体上目的基因片段和链黑霉素抗性实验确认血红素受体基因缺失。【结果】获得不含抗生素基因的马链球菌兽疫亚种血红素受体基因缺失突变株。【结论】用pJR700温度敏感载体系统,构建马链球菌兽疫亚种基因缺失突变株是可行的。     

透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性北大核心CSCD

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。     

噬菌体展示技术筛选抗轮状病毒多肽的试验研究

从噬菌体随机展示十五肽文库筛选出4个与轮状病毒粒子特异性结合多肽。经空斑减少抑制实验和MTT法分析表明其中3个多肽对病毒感染培养细胞具有抑制作用,其中序列为QSNPIHIITNTRNHP的C肽具有显著抑制作用,抑制效果达93%,另外2个多肽A和B抑制效果分别为40%与50%。经过多肽序列分析发现这3个十五肽具有2个保守序列,分别是第2至8个氨基酸残基SNPIHII和第12~15个氨基酸残基NIP。胰蛋白酶水解位点分析表明C肽无裂解位点,而A肽和B肽则分别具有3个和4个潜在水解位点。抑制病毒感染液中胰蛋白酶活性,发现A,B两肽也能显著地抑制病毒离体感染。说明所筛选的多肽2个保守序列的完整对抗病毒感染起着重要作用。C肽有望成为一种治疗轮状病毒感染的口服药物。     

LAK细胞实验室及临床研究的进展

LAK细胞又称淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer Cell)是近年来在生物工程迅速发展的基础上产生的一门高新技术,广泛引起免疫学家和临床学家的极大兴趣。近年来基因重组白细胞介素-2(rIL-2)的深入研究和国产化的成功,更推动着这一新技术的实验室和临床研究在国内的蓬勃发展,取得了可喜的成绩。本文仅就国内外有关这方面的进展结合我们的工作加以概述。     

α-干扰素治疗慢性病毒性肝炎的现状和展望

长期以来α－干扰素治疗慢性乙型和丙型病毒型肝炎是有效的,临床治疗中已得到承认。但大剂量发现副作用明显,口含天然人α－干扰素无副作用,如果能替代α－干扰素并联合其它药物治疗,对病毒性疾病和恶性肿瘤将提供新的治疗方法．     

杆状病毒表达系统的改进及IL-6在昆虫细胞内的表达和纯化

使用同源重组方法,在昆虫细胞内将多角体启动子驱动的EGFP表达盒插入杆状病毒穿梭载体Bacmid的p74位相,经5轮空斑纯化获得重组穿梭载体Bacmid-egfp。然后将Bacmid-egfp转化含转座助手质粒的E.coliDH10B,获得受体菌E.coliDH10Bac-egfp,由于Bacmid-egfp保留了完整的转座结构和α互补功能,因此该菌株和原始E.coliDH10Bac一样能有效的利用各种pFastBac系列的载体进行转座并构建出能指示病毒繁殖和目的基因表达的重组病毒。使用红色荧光蛋白DsRed对系统进行了验证,结果表明重组病毒Bac-egfp-DsRed感染的细胞中绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白均得到了高效表达。进一步使用该系统在昆虫细胞中高效表达并纯化了IL-6蛋白,为研究和应用该细胞因子提供物质基础,同时也进一步证明所改造的杆状病毒表达系统的可靠性和实用性。     

NaCl胁迫对宁夏枸杞叶和幼根显微及超微结构的影响

以宁夏枸杞为材料,采用超薄切片技术制备样品,应用光学显微镜和透射电镜分析了不同浓度NaCl胁迫条件下宁夏枸杞叶和幼根显微及超微结构的变化。结果表明：随着NaCl胁迫的加重,(1)叶片上表皮细胞增厚,栅栏组织细胞出现缩短现象,排列疏松且紊乱;幼根的初生结构无明显变化。(2)叶片栅栏组织中叶绿体不再紧靠在细胞膜上,叶绿体双层膜破坏,基粒片层松散排列,杂乱无章,出现膨胀和空泡现象,淀粉粒和嗜锇颗粒增多,叶肉细胞中线粒体发生轻微变化;幼根中皮层薄壁细胞线粒体形状发生改变,结构破坏,内膜和外膜模糊甚至破裂,大多数嵴模糊,出现空泡现象;细胞核解体,基质外溢。研究表明, 不同浓度的NaCl胁迫对宁夏枸杞叶片和幼根细胞的显微及超微结构影响不同,NaCl浓度大于200 mmol/L时,宁夏枸杞叶片和幼根细胞的显微及超微结构发生了明显变化,且叶肉细胞中线粒体的变化没有叶绿体的变化显著,推测叶肉细胞中线粒体的耐盐性比叶绿体强。     

双组分系统EnvZ/OmpR促进副溶血弧菌抵抗碱胁迫的作用机制

【目的】探究双组分系统(two-component system,TCS)EnvZ/OmpR对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)抵抗碱胁迫的作用机制。【方法】用SMART在线工具(https://smart.embl.de/)鉴定出副溶血弧菌基因组中的双组分系统EnvZ/OmpR,再利用同源重组技术将envZ和ompR基因分别进行缺失,构建相应回补株,比较各菌株的生长曲线来检测相应基因对细菌适应高渗透胁迫和碱胁迫的作用,并结合qRT-PCR及荧光检测系统,筛选参与EnvZ/OmpR抵抗碱胁迫的下游靶基因,鉴定该双组分系统对下游基因的调控机制。【结果】在副溶血弧菌基因组中鉴定出vp0155/vp0154编码EnvZ/OmpR双组分系统同源蛋白。△ompR菌株在高渗透胁迫和碱胁迫中的生长能力明显弱于野生株,而回补株C△ompR、△envZ和C△envZ菌株生长能力与野生株类似。在△ompR菌株中,孔道蛋白基因vp1218、vp0493、vpa1745、vpa0085与vpa1308的转录水平均明显低于野生株,并且发现这些孔道蛋白基因缺失株(△vpa1308除外)在碱性环境中生长能力均明显弱于野生株。OmpR蛋白可直接抑制调控因子AphB基因转录,而△aphB菌株在碱胁迫中的生长能力明显强于野生株。此外,AphB蛋白可直接抑制孔道蛋白基因vp0493和vpa0085转录。【结论】双组分系统EnvZ/OmpR促进副溶血弧菌抵抗碱胁迫,其中OmpR蛋白可通过抑制调控因子AphB的表达,以促进部分孔道蛋白的表达,从而增强副溶血弧菌抵抗碱胁迫的能力。