鼠疫耶尔森菌抗原检测试剂用国家参考品的研制

目的研制鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)抗原检测试剂用国家参考品。方法通过对5株鼠疫耶尔森菌和10株非鼠疫耶尔森菌的菌种检定、培养及灭活、抗原检测,组建鼠疫耶尔森菌抗原检测试剂用国家参考品。对参考品进行样品均匀性以及稳定性评估,组织5家实验室协作标定。结果参考品由5份阳性、10份阴性、1份最低检出量以及1份重复性样品组成,均匀性和稳定性良好。协作标定结果显示:①5份阳性参考品阳性率100%;②10份阴性参考品阴性率100%;③最低检出量参考品的检出量不高于1.0×10~6个菌/mL;④重复性参考品检测反应结果应一致(酶联免疫法、上转发光免疫层析法等CV<5%)。结论建立的鼠疫耶尔森菌抗原检测试剂用国家参考品填补了相关领域的空白,可用于相关试剂的质量控制。     

猴B病毒抗体ELISA检测试剂盒的制备及准确性评价

目的:以金标准试剂盒为参照,对新研制的猴B病毒抗体ELISA检测试剂盒进行准确性评价,以期为我国实验灵长类动物产业提供优质廉价的检测试剂。方法:利用3个批次共表达猴B病毒gD和g B蛋白的细胞上清分别制备ELISA检测试剂盒,与金标准试剂盒(VRL的ELISA试剂盒)同时对667只食蟹猴血清进行检测,考察新研制剂盒的准确性;然后,挑选强阳性、弱阳性、阴性样品,用另外2个批次ELISA试剂盒检测,考察不同批次试剂盒检测结果的稳定性。结果:金标准试剂盒对667只食蟹猴血清抗体检测结果为阳性280份、阴性387份,而新研制的ELISA试剂盒结果为阳性282份、阴性385份;与金标准相比,阳性样品的符合率为98.93%(277/280),阴性样品的符合率为98.97%(383/387),总体符合率为98.95%(660/667)。对100份强阳性样品、70份弱阳性样品、108份阴性样品及7份差异样品的重复检测表明,除1份弱阳性(金标准为阴性)检测为阴性外,其余样品与前期一致。结论:与金标准相比,新研制的试剂盒具有较高的准确性,可用于猴B病毒抗体的检测。     

四种丙型肝炎病毒抗体试剂检测方法的性能评估

对血液筛查的四种丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)抗体试剂检测方法的性能进行评估。方法采用协作标定方式,应用四种检测方法(间接ELISA法、双抗原夹心ELISA法、间接CLIA法、双抗原夹心CLIA法)16种HCV抗体试剂,对经确证筛选出的70份(HCV抗体阳性35份、阴性35份)血浆样本进行检测,通过分析阳性、阴性符合率,评估四种方法 HCV抗体试剂的性能。结果间接ELISA法试剂检测阳性符合率为88.6%(31/35)~94.3%(33/35),双抗原夹心ELISA法、间接CLIA法、双抗原夹心CLIA法试剂检测阳性符合率为91.4%(32/35)~94.3%(33/35),四种检测方法 HCV抗体试剂阳性符合率之间的差异无统计学意义(P0.05);间接ELISA法和间接CLIA法试剂弱阳性样本检出率为11.4%(4/35)~31.4%(11/35),双抗原夹心ELISA法和双抗原夹心CLIA法试剂弱阳性样本检出率为5.7%(2/35)~11.4%(4/35),四种检测方法 HCV抗体试剂对弱阳性样本的检出率之间的差异有统计学意义(P0.05);间接ELISA法试剂检测阴性符合率分别为94.3%(33/35)~100%(35/35),间接CLIA法试剂阴性符合率分别为94.3%(33/35)~97.1%(34/35),双抗原夹心ELISA法和双抗原夹心CLIA法试剂阴性符合率均为97.1%(34/35),四种检测方法 HCV抗体试剂阴性符合率之间的差异无统计学意义(P0.05)。结论四种检测方法 HCV抗体试剂的性能基本一致,不同方法各有优缺点,建议应用多种检测方法对弱阳性样本进行确认检测。     

丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片的制备及临床评价

为了制备丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片,并对其临床应用价值进行评价,将基因工程表达的丙型肝炎病毒分片段抗原,点至经特殊处理的玻片上,制成蛋白质芯片.收集来自三家临床单位用于临床验证的905份血清标本.分别用丙肝病毒分片段抗体检测蛋白质芯片、ELISA丙肝病毒抗体检测试剂进行检测.部分样本同时采用进口RIBA抗体检测试剂进行了检测,分别比较蛋白质芯片法与ELISA法以及RIBA试剂的符合率.结果表明：a.905份血清标本,ELISA法检出阳性294份,阴性611份.阳性标本用蛋白质芯片法检测,融合抗原292份显示阳性结果、2份阴性结果,根据蛋白质芯片的核心抗原,以及NS3, NS4,NS5分片段抗原综合判断确定阳性样本288份阳性,阴性样本2份,4份样本结果不确定.ELISA法检出的611份阴性标本用两种蛋白质芯片法检测,检出阴性均为611份.两种蛋白质芯片法与ELISA法的阳性符合率分别为99.3%和98.9%,与ELISA法的阴性符合率均为100%.用RIBA 试剂检测6份ELISA法为阳性,蛋白质芯片法为非阳性的样本,结果均为非阳性.b.290份经 RIBA试剂确认的阳性标本104份,单片段阳性标本66份,阴性标本120份,用蛋白质芯片法检测,检出阳性标本103份,单片段阳性标本61份,阴性标本126份,二者具有很高的符合率（P＞0.01）.丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片,检测灵敏度和特异性高于ELISA法,对血清样本的确认程度与进口的RIBA试剂高度一致,具有操作简便,费用低廉的特点,是一种新型、高效的体外诊断试剂.     

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.     

牛传染性鼻气管炎病毒重组gE蛋白间接ELISA诊断方法的建立

以重组牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白,经纯化后作为诊断抗原建立了检测牛血清特异性gE抗体的间接酶联免疫吸附试验,确定其最佳包被量为每孔1.075μg。样品稀释度为1:40,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶5000。判定标准为样品OD值大于0.582为阳性,小于0.472为阴性,在0.472与0.582之间为可疑。经抗特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。在403份血清样品中,进口试剂盒检出234份阳性样品,该诊断方法检出248阳性样品,与进口试剂盒的符合率为94.3%,但该诊断方法检出率更高。在43份血清样品中,中和试验检出24份阳性样品,该诊断方法检出28份阳性样品,与中和试验的符合率为85.7%。应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染率,发现这些地区的IBRV感染率为68.7%。     

鼠疫溶菌疫苗免疫小鼠的体液免疫应答

为选择以F1抗原为主要有效成分的鼠疫溶菌疫苗(Whole cell lysate of Yersinia pestis vaccine,WCLY)的免疫程序,设计了这组试验。在37℃培养鼠疫EV菌,通过超声波裂解法制备鼠疫溶菌疫苗。设计(0,2周)、(0,4周)、(0,2,4周)三种免疫程序,以每剂总蛋白量7.9μg、31.5μg和126.0μg三个剂量皮下接种NIH小鼠。分别在第一针免疫后2、4、8、12周采集血清,通过间接ELISA检测抗鼠疫菌F1抗原和总抗原抗体。结果显示:免疫后血清抗体上升很快,2周内即可测出;无论哪种免疫程序,至12周时抗体滴度仍保持高水平;加强免疫后,抗体水平在4周或8周达到较高,可与活疫苗免疫者相比;溶菌疫苗的接种剂量为7.9μg时,动物只出现轻度不良反应。提示鼠疫溶菌疫苗需要两剂免疫,最短可间隔2周,接种剂量应不超过7.9μg,疫苗中应富含F1抗原。     

Dot-ELISA法检测血液及唾液HIV抗体的应用评价

评价人类免疫缺陷病毒1+2型抗体检测试剂盒(Dot-ELISA法)检测血清和唾液样本的临床性能。采用对照试验研究,选取背景清晰的研究对象200例,采集同一研究对象的血清和唾液样本,应用万泰生物药业公司生产的人类免疫缺陷病毒1+2型抗体检测试剂盒作为考核试剂,法国生物梅里埃公司生产的人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(ELISA法)作为参考试剂,考核试剂检测结果与参考试剂及研究对象背景进行比较分析。考核试剂检测血清HIV抗体与参考试剂相比较,阳性符合率100%,阴性符合率100%,总符合率100%,Kappa值1.00,一致性为最强;考核试剂检测唾液HIV抗体与参考试剂检测结果相比较,阳性符合率98.78%,阴性符合率100%,总符合率99.50%,Kappa值0.99,一致性为最强。Dot-ELISA法人类免疫缺陷病毒1+2型抗体检测试剂盒对血清及唾液样本检测性能优越,适合HIV抗体快速筛查。     

鼠疫菌PsaA 抗原的表达及抗体制备和应用

目的:制备鼠疫菌PsaA抗原及抗体,建立针对PsaA抗体的快速检测方法,并检测鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率。方法:利用PCR方法扩增出PsaA蛋白基因片段,在大肠杆菌原核表达系统中表达出重组PsaA抗原,以镍柱亲和层析纯化包涵体形式的表达蛋白,以尿素梯度透析复性成可溶蛋白。再以表达蛋白为免疫原,常规免疫家兔,收集兔血清制备多抗,并以正辛酸-硫酸铵法提纯获得PsaA抗体IgG。利用得到的PsaA抗原和抗体为材料,建立两种检测PsaA抗体的快速检测方法,即间接ELISA法和上转换发光(Up-converting Phospher Technology,UPT)免疫层析试纸条法。最后利用这两种方法检测18份猴血清标本中的PsaA抗体。结果:鼠疫菌感染猴血清标本中PsaA抗体的阳性率为62%(8/13)。结论:成功建立了针对鼠疫菌PsaA抗体的快速检测方法,并检测到13份鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率为62%。     

鼠疫菌PsaA抗原的表达及抗体制备和应用

目的：制备鼠疫菌PsaA抗原及抗体,建立针对PsaA抗体的快速检测方法,并检测鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率。方法：利用PCR方法扩增出PsaA蛋白基因片段,在大肠杆菌原核表达系统中表达出重组PsaA抗原,以镍柱亲和层析纯化包涵体形式的表达蛋白,以尿素梯度透析复性成可溶蛋白。再以表达蛋白为免疫原,常规免疫家兔,收集兔血清制备多抗,并以正辛酸-硫酸铵法提纯获得PsaA抗体IgG。利用得到的PsaA抗原和抗体为材料,建立两种检测PsaA抗体的快速检测方法,即间接ELISA法和上转换发光（Up-converting Phospher Technology,UPT）免疫层析试纸条法。最后利用这两种方法检测18份猴血清标本中的PsaA抗体。结果：鼠疫菌感染猴血清标本中PsaA抗体的阳性率为62%（8/13）。结论：成功建立了针对鼠疫菌PsaA抗体的快速检测方法,并检测到13份鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率为62%。     

Evaluation of a standardized F1 capsular antigen capture ELISA test kit for the rapid diagnosis of plague

Rapid detection of soluble F1 capsular antigen in serum, bubo fluid or urine of patients proved to be a valuable tool in the presumptive diagnosis of plague. We evaluated a F1 capsular antigen capture ELISA resembling a commercially available test kit. The minimal detectable concentration was 4 ng/ml. The specificity was 100% when investigating 47 sera from healthy Malagasy subjects and 98.4% when 365 sera from German blood donors were studied. Sensitivity was determined on sera (n=11) and buboes (n=18) from bacteriologically confirmed Malagasy plague patients. Sensitivity was 90.1% for serum and 100% for buboes. A standardized F1 capsular antigen capture ELISA test kit might be well suited for the early detection of plague particularly in non-endemic areas where clinical microbiological laboratories have only limited access to alternative techniques for rapid identification of Yersinia pestis.     

Technical note: a rapid diagnostic test detects plague in ancient human remains: an example of the interaction between archeological and biological approaches (southeastern France, 16th-18th centuries)

A rapid diagnostic test (RDT) that detects Yersinia pestis F1 antigen was applied to 28 putative plague victims exhumed from seven burial sites in southeastern France dating to the 16th-18th centuries. Yersinia pestis F1 antigen was detected in 19 of the 28 (67.9%) samples. The 27 samples used as negative controls yielded negative results. Soil samples taken from archeological sites related to both positive and negative samples tested negative for F1 antigen. The detection threshold of the RDT for plague (0.5 ng/ml) is sufficient for a preliminary retrospective diagnosis of Y. pestis infection in human remains. The high specificity and sensitivity of the assay were confirmed. For two sites positive to F1 antigen (Lambesc and Marseille), Y. pestis-specific DNA (pla gene) had been identified previously by PCR-sequence based analyses. Specifically, the positive results for two samples, from the Lambesc cemetery and the Marseille pit burial, matched those previously reported using PCR. Independent analyses in Italy and France of different samples taken from the same burial sites (Draguignan and Martigues) led to the identification of both Y. pestis F1 antigen and Y. pestis pla and gplD genes. These data are clear evidence of the presence of Y. pestis in the ancient human remains examined in this study.     

猴T淋巴细胞趋向性病毒1型双抗原夹心ELISA检测试剂盒的研制

目的研制灵敏度和特异性高的检测实验猴血清中T淋巴细胞趋向性病毒-1型（STLV-1型）／E体的双抗原夹心ELISA（dsELISA）检测试剂盒。方法采用经原核表达系统表达并纯化的人T淋巴细胞白血病病毒-1型（HTLV-1型）的Env蛋白作为包被用抗原,建立了检测STLV-1的dsELISA诊断方法。通过优化反应条件和筛选试剂,确定了dsELISA诊断试剂盒的相关条件,并经敏感性、特异性和重复性试验考查该试剂盒质量。结果试剂盒特异性好,批内重复试验变异系数（CV）〈7％,批间重复试验CV〈10％。对200份猴血清进行随机检测,与国际公认的诊断试剂盒（美国BioReliance公司）的符合率为97％。结论本试剂盒可初步应用于临床上实验猴STLV-1型抗体的检测。     

人tPA信号肽和Yersinia Pestis保护性抗原F1-V融合基因的构建及其免疫效果观察

为获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因以及人tPA信号肽基因的重组质粒tPA-pVAX1/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力, 用PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pVAX1/F1-V融合重组质粒.PCR扩增tPA信号肽片段并将其插入到F1-V的上游,构建tPA-pVAX1/F1-V融合重组质粒;转染COS-7细胞,Western blot法鉴定目的蛋白的表达.重组质粒tPA-pVAX1/F1-V加GM-CSF佐剂免疫BALB/c小鼠,观察免疫效果.400个LD50强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率.结果表明,tPA-pVAX1/F1-V在COS-7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体;抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明,所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主;&#61472;攻毒保护率达90%.结果提示,已成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体tPA-pVAX1/F1-V,且具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力, 对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础.     

丙型肝炎病毒抗体化学发光免疫检测方法的建立及其临床应用简

目的：建立丙型肝炎病毒（rmv）抗体化学发光免疫检测方法,并分析其临床应用价值。方法：应用基因工程重组的HCV抗原包被微孔板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗,并结合鲁米诺化学发光底物系统,建立HCV抗体化学发光免疫检测方法;应用HCV抗体诊断试剂国家参考品分析所建立方法的特异性、灵敏度、稳定性和精密性,并-9北京万泰公司的ELISA试剂盒同时检测临床血清样本350份,比较检测结果。结果：检测结果符合国家参考品质量标准。批内变异系数5．1％。6．6％,批间变异系数9-5％;试剂盒置37℃考核3d,其稳定性良好;与万泰公司的ELISA检测结果对照,阳性符合率分别为99．0％,阴性符合率分别为100％,总符合率为99．4％;Kappa值为0．986,一致性强度最强。结论：建立了特异、敏感和稳定的HCV抗体化学发光免疫检测方法,适用于HCV感染的批量筛查,具有较大的临床应用价值。     

金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌

目的:建立金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌(土拉菌)的方法,评价其灵敏度、特异性、重复性及其应用。方法:以小鼠抗土拉菌脂多糖单克隆抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜、兔抗土拉菌多克隆抗体作为检测抗体标记胶体金,通过金标银染技术放大检测信号,建立金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌体系;评价该方法的灵敏度、特异性和重复性;以经荧光定量PCR定量的土拉弗朗西斯菌为检测对象,比较金标银染免疫渗滤法和免疫层析法。结果:金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌的最小检出量为1.0×103 CFU/mL,灵敏度高于免疫层析法;检测大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁菌和鼠疫耶尔森菌的结果均为阴性;密封保存的检测卡80 d内重复性良好,100 d后反应强度略有降低。结论:金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌敏感性高、特异性强、重复性好,且方便快捷,不需要仪器设备,可作为快速检测土拉弗朗西斯菌的首选方法。     

Antigenic profiling of yersinia pestis infection in the Wyoming coyote (Canis latrans)

Although Yersinia pestis is classified as a "high-virulence" pathogen, some host species are variably susceptible to disease. Coyotes (Canis latrans) exhibit mild, if any, symptoms during infection, but antibody production occurs postinfection. This immune response has been reported to be against the F1 capsule, although little subsequent characterization has been conducted. To further define the nature of coyote humoral immunity to plague, qualitative serology was conducted to assess the antiplague antibody repertoire. Humoral responses to six plasmid-encoded Y. pestis virulence factors were first examined. Of 20 individual immune coyotes, 90% were reactive to at least one other antigen in the panel other than F1. The frequency of reactivity to low calcium response plasmid (pLcr)-encoded Yersinia protein kinase A (YpkA) and Yersinia outer protein D (YopD) was significantly greater than that previously observed in a murine model for plague. Additionally, both V antigen and plasminogen activator were reactive with over half of the serum samples tested. Reactivity to F1 was markedly less frequent in coyotes (35%). Twenty previously tested antibody-negative samples were also examined. While the majority were negative across the panel, 15% were positive for 1-3 non-F1 antigens. In vivo-induced antigen technology employed to identify novel chromosomal genes of Y. pestis that are up-regulated during infection resulted in the identification of five proteins, including a flagellar component (FliP) that was uniquely reactive with the coyote serum compared with immune serum from two other host species. Collectively, these data suggest that humoral immunity to pLcr-encoded antigens and the pesticin plasmid (pPst)-encoded Pla antigen may be relevant to plague resistance in coyotes. The serologic profile of Y. pestis chromosomal antigens up-regulated in vivo specific to C. latrans may provide insight into the differences in the pathogen-host responses during Y. pestis infection.     

Evaluation of three serological tests for the detection of human plague in northeast Brazil.

The passive haemagglutination (PHA) test, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the dot enzyme-immunosorbent assay (DOT-ELISA) were used to detect the levels of IgG antibodies against the Fraction 1 (F1) antigen of Yersinia pestis in sera of plague-infected patients from Northeast Brazil. Twenty three selected PHA-positive sera of subjects with bacteriological confirmation of plague were also positive in the DOT-ELISA but only 19 were detected by the conventional ELISA technique. Another group of 186 serum samples from subjects diagnosed as plague-infected by clinical and epidemiological parameters, but PHA-negative, were screened with DOT-ELISA and 11 gave positive results. The specificity of the assays on the serological detection of plague was confirmed in inhibition tests using purified F1 antigen. These results suggest that DOT-ELISA can be an useful, simple and more sensitive alternative for the serodiagnosis of plague in Northeast Brazil.     

一种快速检测甲型流感病毒的方法

目的 开发一种快速、简便的基于胶体金免疫层析法（GICA）的试剂盒,以用于对甲型流感病毒的检测。方法以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗甲型流感病毒内部抗原的单克隆抗体。硝酸纤维素膜上包被两种抗甲型流感病毒单克隆抗体的混合液,制成免疫层析试纸。待测样品中的甲型流感病毒首先与胶体金标记抗体结合,后移动至硝酸纤维素上与固定的单克隆抗体发生反应,形成肉眼可见的红色带。结果GICA试纸条与甲1型和甲3型流感病毒共16种毒株均能发生特异性反应,与乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒无交叉反应。用三种不同甲型流感病毒毒株的不同浓度标本与美国同类经过FDA批准的产品比较,灵敏度相同。结论GICA试纸条灵敏度能够达到临床使用的要求,并具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点,对甲型流感的诊断和流行病学调查具有十分重要的应用价值。     

五种国产与进口小鼠病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

目的评价国产小鼠病毒抗体ELISA检测试剂盒。方法选择国产与进口小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、肝炎病毒（MHV）、仙台病毒（SV）、腺病毒（MAV）、细小病毒（MPV）ELISA抗体检测试剂盒,进行敏感性、特异性、精密性、稳定性、可信度试验比较。结果国产与进口试剂盒：同种试剂盒之间灵敏度相差最低为2倍,差异显著（P〈0.05）,最高为16倍,差异极显著（P〈0.01）;特异性试验显示每种试剂盒,与其他4种病毒均无交叉反应;精密性试验显示5种试剂盒批内平均变异系数均小于10%;稳定性试验显示5种试剂盒相对偏差均小于25%;分别选择已知36份小鼠血清进行检测,国产和进口LCMV、MHV、SV、MPV符合率均为100%;国产MAV符合率为86.1%,进口MAV符合率均为100%,二者之间差异极显著（P〈0.01）。结论除国产MAV试剂盒敏感性、可信度低于进口外,国产LCMV、MHV、SV、MPV试剂盒与进口同种试剂盒相比,在敏感性、特异性、精密性、稳定性和可信度方面均良好。