重组人生长激素在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达研究

对重组人生长激素基因工程菌ｐＥＴ－１１ｂ／ｒｈＧＨ／ＢＬ２１的培养条件进行了优化,在ＮＢＳ ＭＰＰ－４０发酵罐中实现了高密度培养和高效表达,三批实验结果表明,在较短的发酵时间（１２ｈ）内细菌干重达８５ｇ／Ｌ,重组人生长激素占总蛋白量的２５％左右。     

分泌型重组人生长激素的研制

从人脑垂体组织中克隆了人生长激素基因并构建了分泌型表达基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ８０２／ｐＡＶＧＨ。研制的ｒｈＧＨ中试产品,各项技术指标均达到临床应用要求     

重组人粒细胞集落刺激因子的纯化

重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）在工程菌ｐＣＧ－１／ｒｈＧ－ＣＳＦ／ＤＨ５ａ中以无活性的包涵体形式大量表达。经过菌体破碎分离包涵体、包涵体变性复性后,ｒｈＧ－ＣＳＦ的活性得到恢复。用离子交换和疏水层析纯化了ｒｈＧ－ＣＳＦ,比活性达１．５７×１０８ｕ／ｍｇ,纯度大于９８％。     

重组人生长激素的主要药效学研究

参照文献方法,观察了ｒｈＧＨ对正常大鼠（３月龄,平台期）生长发育作用的影响,ｉｍ,ｒｈＧＨ（０．０５、０．１５、０．４５ｍｇ．ｋｇ＾－１．ｄ＾－１）,连续１５天,结果表明：ｒｈＧＨ（０．１５、０．４５ｍｇ．ｋｇ＾－１．ｄ＾－１）同阳性对照生长激素ＮＩＢＳＣ标准品）一样,均可明显促进正常平台期大鼠的体重及尾长增加,大剂量组还可明显促进肝、肾及骨骼的生长发育,使肝、肾重量增加,胫骨骨骺端距离增大,同     

鱼类消化道具有吸收外源生长激素的能力

采用草鱼生长激素夹心式酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）,研究了重组鲤生长激素（ｒｃＧＨ）经胃或肠灌注后,胡子鲶、大口鲶和银鲫血清ＧＨ水平的变化规律。胡子鲶、大口鲶直肠分别灌注ｒｃＧＨ（１μｇ／ｇ和５μｇ／ｇ）后,血清ＧＨ水平迅速升高,而在对照组胡子鲶和大口鲶血清中未检测到内源性的ＧＨ,预示处理组血清ＧＨ水平的迅速升高是由ｒｃＧＨ从小肠内转移进血液引起的。胡子鲶胃内灌注ｒｃＧＨ（２５μｇ／ｇ）后,在     

鲤鱼(Cyprinus carpio)生长激素基因克隆及原核表达

采用逆转录—聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从鲤鱼脑垂体总ＲＮＡ中扩增出编码鲤鱼生长激素（ＧＨ）成熟肽基因序列．定向克隆至质粒ｐＵＣ１８,克隆的鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ不含信号肽序列并以新的起始密码子ＡＴＧ取代鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ第１个密码子ＴＣＡ．序列分析表明,与Ｋｏｒｅｎ报道的鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ相比有两个碱基差异,但推断的氨基酸序列完全一致．将鲤鱼ＧＨｃＤＮＡ定向克隆至原核表达载体ｐＢＶ２２０,构建成重组鲤鱼ＧＨ基因表达载体ｐＢＶｃＧＨ８．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：经４２℃诱导,ｐＢＶｃＧＨ８在大肠杆菌中可表达一分子量约２２０００的特异蛋白,表达量占细胞总蛋白的２９．２％．该基因重组的鲤鱼ＧＨ添加到饲料中投喂罗非鱼,证实有明显的促进生长作用     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

草鱼生长激素非竞争式酶联免疫吸附测定法的建立及鉴定

应用草鱼生长激素（ｇｃＧＨ）单克隆抗体及多价兔抗血清建立了草鱼ＧＨ非竞争式酶’联免疫吸附测定ＥＬＩＳＡ系统。用正辛酸法对腹水单抗进行了分离纯化,获得了高纯度的单抗制备物。聚丙烯酸胺凝胶电泳表明纯化的单抗由分子量分别为５５ｋＤ和２５ｋＤ的两条蛋白带组成。用纯化单抗铺底,用兔抗血清作后续抗体建立了一种测定草鱼ＧＨ的非竞争式双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。交叉试验表明该测定系统只与草鱼ＧＨ和基因重组鲤生长激素（ｒｃＧＨ）具有剂量依存的结合反应,而与大马哈鱼生长激素（ｓＧＨ）、牛生长激素（ｂＧＨ）、大马哈鱼促性腺激素（ｓＧｔＨ）、及黑鲢促性腺激素（ｂｓｃＧｔＨ）等均无交叉反应。该 ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度可达０．８ｎｇ／ｍｌ,组内变异系数为 ５．９ ％,组间变异系数为７．６％,回收率达９０％以上。初步应用表明,鲤和团头鲂垂体抽提液、草鱼血清、鲤血清及鲫血清在该测定系统中有剂量依存的反应曲线,而大口鲶、黄颡鱼、中华鲟及黄鳝鱼垂体抽提液及大口鲶、胡子鲶和罗非鱼血清在该测定系统中没有交叉反应。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素（ｐＧＨ）基因的ｃＤＮＡ进行测序,得到ｐＧＨｃＤＮＡ的全序列,并与Ｓｅｅｂｕｒｇ等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白ＸＩＶ启动子的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４构建出含ｐＧＨ基因的重组质粒ｐＸ３／４－ｐＧＨ。将ｐＸ３／４－ｐＧＨ与致死缺失型线性化ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,构建出既能形成多角体又能表达ｐＧＨ基因的苜蓿丫纹夜蛾     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０＾６细胞（２４ｈ）,用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ,同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０＾６细胞（２４ｈ）     

酵母菌SH2发酵产物增强干扰素抗病毒活性及其有效成分的初步研究

酵母菌 Ｓ Ｈ２ 发酵产物（ 简称 Ｆ Ｓ Ｈ２） ,用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 凝胶层析和 Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ 色谱层析分离纯化,收集到一组蛋白。该组蛋白在 Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳上带型一致,无蛋白亚基,分子量范围为５２ ～７２ ｋ Ｄ。凝胶上糖蛋白的特异性染色——— Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ 染色显示阳性染色带;用 Ｌｏｗｒｙ’ｓ 法测蛋白和硫酸酚法测糖,显示蛋白与糖的比例约为３∶１ 。该组蛋白与人α干扰素作用,增强干扰素生物学效价分别为１ ．６ ～２ ．８ 倍和１ ．４ ～４ ．０ 倍;经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 凝胶层析的 Ｆ Ｓ Ｈ２ 蛋白洗脱峰增效２ ．０１ ～５ ．６８ 倍;发酵液增效１ ．６４ ～６ ．８６ 倍。并证实酵母菌 Ｓ Ｈ２ 增效干扰素的活性成分为５２ ～７２ｋ Ｄ 分子量范围的胞外糖蛋白（ 简称 Ｙ Ｅ Ｇ Ｐｓ） 。     

生长激素和生长激素受体的分子生物学

1 .生长激素的结构生长激素 (ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ ,ＧＨ)一般含有 1 91个氨基酸 ,约 2 2ｋＤ。猪与牛的ＧＨ氨基酸序列具有高度的同源性 (约 90 % ) [1] 。猪和牛的ＧＨ对人没有促进生长的作用 ,可能是猪和牛ＧＨ对人的生长激素受体(ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ ,ＧＨＲ )的结合亲和性低于人ＧＨ对人ＧＨＲ的结合亲和性的缘故。ＧＨｍＲＮＡ翻译的初级产物是前生长激素 ,它比成熟ＧＨ在Ｎ端多出 2 6个氨基酸残基的疏水信号肽[2 ] 。通过Ｘ射线衍射技术等研究发现 ,ＧＨ由 4个螺旋组成 ,自Ｎ端至Ｃ端依次为螺旋 1～ …     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ。同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。     

高效的骨诱导生长因子——成骨蛋白-1

成骨蛋白１（ＯＰ１）又称骨形态发生蛋白７（ＢＭＰ７）,属转化生长因子β（ＴＧＦβ）超家族成员．重组人ＯＰ１（ｒｈＯＰ１）在体内和体外都显示了高效的骨诱导活性,可使多种实验动物的骨缺损满意愈合,有良好的临床应用前景     

雌性激素影响大鼠生长激素结合蛋白水平

雌性激素影响大鼠生长激素结合蛋白水平在正常大鼠中,雌性鼠循环血中的生长素结合蛋白（ＧＨＢＰ）水平比雄性鼠高,而在生长素缺乏的侏儒鼠,血浆中的ＧＨＢＰ没有性别差异。为了研究性激素和生长素在ＧＨＢＰ和生长素受体调节上的作用,作者用正常鼠、侏儒鼠、切除垂体...     

金鱼生长激素Ⅱ基因在杆状病毒中的表达

以ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３为转移载体,将编码金鱼生长激素Ⅱ的ｃＤＮＡ插入粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）基因组中,构建了重组病毒株ＴｎＮＰＶＳＸ＋ｇｆＧＨⅡ４６。该毒株能在草地贪夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）离体培养细胞及银纹夜蛾（Ａｇｙｒｏｇｒａｍｍａａｇｎａｔａ）幼虫中表达金鱼生长激素基因。蛋白免疫印迹表明,表达的生长激素蛋白分子量为２２．５ｋＤａ,与理论计算值相符,且表达的生长激素可分泌到感染细胞的培养基及虫体血淋巴中。ＲＩＡ结果表明,表达产物与天然的生长激素有相似的免疫特性,重组病毒在感染细胞９６ｈｐｉ所表达的生长激素达到最高水平,平均每１０５个细胞可在细胞培养基中检测到金鱼生长激素Ⅱ达８６．７４ｎｇ;平均每克干虫可产生金鱼生长激素Ⅱ２１４μｇ。     

金鱼生长激素II基因在杆状病毒中的表达

以ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３为转移载体,将编码金鱼生长激素Ⅱ的ｃＤＮＡ插入粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）基因组中,构建了重组病毒株ＴｎＮＰＶ－ＳＸ＾＋ｇｆＧＨⅡ４６。该毒株能在草地贪夜蛾离体培养细胞及银纹夜蛾幼虫中表达金鱼生长激素基因。蛋白免疫印迹表明,表达的生长激素蛋白分子量为２２．５ｋＤａ,与理论计算值相符,且表达的生长激素可分泌到感染细胞的培养基及虫体血淋巴中。ＲＩＡ结果表明,表达产物与天     

鱼类精子携带源基因导入

将鲤鱼（或泥鳅）精子在保存液内与人生长激素（ｈＧＨ）重组质粒ＤＮＡ保温,再与鲤（或泥鳅）卵受精。由此发育的鱼苗经ＤＮＡ分子杂交和ＰＣＲ检测证明,３３．３％（或３７．０％）的个体带ｈＧＨ基因,其拷贝数在４－１５０／细胞之间。在一定条件下,精子可作为携带外源基因的载体,通过受精作用产生转基因鱼。     

鱼类精子携带的外源基因导入

将鲤鱼（或泥鳅）精子在保存液内与人生长激素（ｈＧＨ）重组质粒ＤＮＡ保温,再与鲤（或泥鳅）卵受精。由此发育的鱼苗经ＤＮＡ分子杂交和ＰＣＲ检测证明,３３．３％（或３７．０％）的个体带ｈＧＨ基因,其拷贝数在４—１５０／细胞之间。在一定条件下,精子可作为携带外源基因的载体,通过受精作用产生转基因鱼。