表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pVI75转移质粒,并将HIV-I中国主要流行株B'/C重组株CN54 gagpol基因置于pVI75的启动子pE/L下,构建重组质粒pVI75-Gagpol.重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞.前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒.结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失;PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Western blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白.     

适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建

为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75.为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞.筛选得到的重组病毒经PCR和Dot blot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上.Westem blot检测结果表明,目的基因的表达正确.痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考.     

表达HIV-1多价合成基因的重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制适合我国使用的HIV疫苗,选择具有代表意义的中国流行株HIV CN54(B′/C)病毒gag、pol、nef等基因的合成基因syngpnef,插入到自行构建的能在病毒筛选过程中将标记基因去除掉的双标记基因痘苗病毒载体pVI75的KpnI酶切位点,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,与我国的天坛株痘苗病毒共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝白斑筛选得到的重组病毒疫苗株DNA。经PCR鉴定标记基因已被删除并有目的基因的整合,Western blot可检测到目的基因的融合表达。此重组病毒疫苗株有望成为HIV/AIDS候选疫苗。     

甲3型流感病毒M2基因在痘苗病毒天坛株中的表达

为获得表达甲3型流感病毒(H3N2)M2蛋白的重组天坛株痘苗病毒RVJ1175M2,使用PCR方法扩增流感病毒全长M2基因,将其克隆到天坛株痘苗病毒同源重组质粒pJSC1175中,获得重组质粒pJSC1175M2,通过与痘苗病毒载体同源重组,构建了含流感病毒M2基因的重组痘苗病毒株RVJ1175M2。PCR检测结果证明,流感病毒(H3N2)M2蛋白基因准确插入到天坛株痘苗病毒TK区;Western blot、免疫荧光和流式细胞计数表明重组病毒RVJ1175M2可以有效地表达M2蛋白,表达的M2蛋白有两条带,分别为15kD和13kD,与相关文献报道一致;M2蛋白可有效分布在感染细胞的细胞膜上。这些结果表明重组痘苗病毒株RVJ1175M2可以有效地表达流感病毒M2蛋白,为使用表达M2蛋白的不同类型疫苗进行广谱流感疫苗效果的比较研究奠定了基础。     

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法,对HPV581L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰,并保留氨基酸不变.选用非复制型重组痘苗病毒为载体,将修饰的L1基因1.5kb和L2基因1.4kb分别插入痘苗病毒表达载体pJSD的7.5k和H6早期启动子之后,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组.经单斑筛选纯化,获得共表达HPV58L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株.该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交分析,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV581L1及L2蛋白.此结果为HPV58型非复制型重组痘苗病毒疫苗人用株的研究打下了基础.     

高效重组痘苗病毒天坛株载体系统的建立

以痘苗病毒为载体的溶瘤病毒作为癌症治疗的新方向效果显著。同时,痘苗病毒还可以作为疫苗载体抵抗HIV、H5N1等病毒感染。因技术限制,重组痘苗病毒主要通过同源重组的方法获得,但此方法获得重组病毒的效率较低。随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9技术成功应用于多种动物、组织和细胞的基因编辑中,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术建立高效重组痘苗载体系统。本研究首先构建了三个靶向痘苗病毒天坛株TK区的gRNA-Cas9的质粒以及重组质粒pJ2R-EGFP,通过瞬时转染gRNA-Cas9或建立gRNA-Cas9稳定细胞系后,导入重组质粒pJ2R-EGFP并感染VTT,获得表达EGFP的重组病毒。此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率比传统的同源重组方法大大提高。因此,本研究建立的高效痘苗病毒载体重组系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值。     

双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果

为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒aG株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRGΔCKRN。采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间。经核酸及蛋白水平检测表明VTKRGΔCKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性。重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱。VTKRGΔCKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击。以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体。非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRGΔCKRN免疫效果好、更具安全性。     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、     

双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果

为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒Ag株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKRN.采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间.经核酸及蛋白水平检测表明VTKRG△CKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性.重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱.VTKRG△CKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击.以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体.非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRG△CKRN免疫效果好、更具安全性.     

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE／L启动子下游,通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv—DINenv和rvv—LNenv,Westem blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28％。本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础。     

汉滩病毒糖蛋白G1G2和核蛋白NP在痘苗病毒天坛株中的联合表达

以汉滩病毒７６／１１８株Ｍ、Ｓ片段分别插入转南粒ＰＪＳＢ１１７５的Ｐ１１和Ｐ７．５启动子下游,构建成重组质粒ＰＪＳＢ１１７．５Ｓ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染针重组质粒分别与痘苗病毒天坛株ＴＫｖｖ和表达Ｓ片的重线痘苗病毒ＶＪＳＡ１１７５Ｓ进行共转染,免疫酶斑和蓝白筛法筛选并纯化,得到了重组病毒ＶＪＳＢ１１Ｍ５Ｓ。Ｂｕｄｒ的选择压力试验表明,外源基因确定插入在ＴＫ基因区;ＰＣＲ及打点杂交证实了两个片     

修饰的痘苗病毒安卡拉株（MVA）基因组中高频的同源重组

痘苗病毒由于其外源基因容量大,表达产物后加工完善等优势而广泛用于基因工程的研究以及基因治疗,痘苗病毒基因组的同源重组现象为其基因操作带来了方便,也被用于很多痘苗病毒基因结构和功能的研究,痘苗病毒安卡拉株（MVA）是一种修饰的复制限制的痘苗病毒,由于极高的安全性,正在实验室和临床应用的很多领域取代普通的痘苗病毒,为提高重组MVA系统的安全性以及筛选重组MVA的效率,发展了一种暂时选择系统,此系统利用分子内2段同向的相同序列发生同源重组去除选择标记k1l基因,从而消除选择标记对宿主可能的危害。利用此暂时表达系统构建了4个携带编码不同长度外源多蛋白质序列的重组MVA,并估算了每次传代的重组频率,结果显示,MVA同源重组频率虽然比其他痘苗病毒株要低,但仍然是较斋的,将带有k1l基因的重组MVA经3-4次盲传（blind passage),即可获得完全去除选择标记的重组MVA。进一步证明上述利用暂时选择标记k1l基因构建重组MVA的系统具有十分可靠的安全性,适合作为人体活疫苗开发和基因治疗的载体,而且,通过盲传进行筛选,能大大提高去除选择标记的效率,降低鸺建重组MVA的成本。     

含HIV-1 gag、gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒的构建及其免疫原性的研究

将HIV－1中国株42（B亚型）gag基因及gag与gp120 V3区的嵌合基因gag V3插入腺病毒伴随病毒（AAV）表达载体（pSNAV）质粒中,构建重组质粒pSNAV-gag及pSNAV-gagV3;采用脂质体转染的方法分别将重组质粒转入BHK细胞,G418筛选得到转入重组质粒并能表达外源基因的细胞系,命名为BHK－gag及BHK－gagV3。用具有重组腺病毒伴随病毒（rAAV）包装功能的一种重组单纯疱疹病毒（rHSV）分析感染这两株细胞系,纯化后得到rAAV,电镜观察可见到大量实心病毒颗粒,核酸杂交检测重组病毒滴度达到10^12病毒颗粒／ml,重组病毒感染293细胞,ELISA检测有gag及gagV3基因的表达。用重组病毒免疫Balb/C小鼠,检测抗体及细胞免疫水平,证明重组病毒可以在小鼠体内诱导产生细胞及体液免疫。     

流行性乙型脑炎病毒GSS株prM、E和NS1蛋白基因的克隆及在非复制型痘苗病毒中的表达

克隆流行性乙型脑炎(乙脑)病毒野毒(JEV)GSS株前膜蛋白信号序列、前膜蛋白(prM)、包膜蛋白(E)、非结构蛋白-1(NSl)和非结构蛋白NS2a的编码基因,并与非复制型痘苗病毒载体NTV进行同源重组,构建了乙脑病毒非复制型重组痘苗病毒疫苗株NTVA(E／L)JEV。通过：PCR和Southern blot检测证明,在非复制型痘苗病毒中有乙暗病毒prM信号序列、prM、E、NS1和NS2a基因的插入：Western blot检测证明,重组病毒可以在细胞内成功地表达prM、E和NSl蛋白,并可将prM、E和NSl蛋白分泌到细胞培养上清中;免疫荧光检测证明,E和NSl蛋白主要分布在细胞膜上。电镜下可见分泌到细胞外的病毒样颗粒。     

一株产G418单组分工程菌的构建

【目的】定向改造庆大霉素产生菌绛红小单孢菌G1008,获得产G418单组分工程菌。【方法】以温敏型穿梭质粒p KC1139为载体,构建敲除基因genQ*重组质粒p QB303,通过接合转移,导入绛红小单孢菌G1008中,影印筛选和PCR鉴定genQ*框内缺失突变菌,利用TLC和MS分析其代谢产物组分。【结果】获得一株genQ*缺失工程菌Micromonospora purpurea GQ175,其代谢产物为G418单组分,生物效价达828 mg/L,与出发菌G1008的产抗能力相当。【结论】工程菌GQ175产G418单组分,具有很好的工业开发价值。同时,证明绛红小单孢菌G1008中,庆大霉素C-6′脱氢酶基因为genQ*,且无其他同功酶基因。     

HIV-1gag/IFNα-2b的构建与表达鉴定

目的：构建艾滋病病毒核心蛋白(gag)与干扰素(IFNα-2b)融合基因表达质粒,观察其在痘苗病毒中共表达结果,研究其意义。方法：利用基因重组技术,将IFNα-2b基因片段插入到gag基因的nt531位点,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选,挑出重组痘苗病毒。经免疫荧光、Western blot和Dot-ELISA鉴定表送产物。结果：间接免疫荧光实验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹实验与Dot-EILSA结果均显示重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gag／IFNα-2b蛋白。结论：成功地构建了重组真核细胞表达质粒,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

用免疫蚀斑方法筛选重组痘苗病毒疫苗株

用间接免疫酶方法在硝酸纤维膜上检查,筛选和回收重线痘苗病毒。作为人用疫苗株的筛选,此法较核酸杂交方法更简便,直观和准确,在筛选重组病毒的同时确定了病毒在感染细胞上的表达。构建了含痘苗病毒７．５Ｋ启动子和ＥＢ病毒膜抗原基因的转移载体,从转染的病毒混合液中用特异性ＭｃＡｂ和间接免疫酶方法直接筛选表达ＥＢ病毒膜抗原的重组痘苗病毒,并从阳性酶斑中回收具感染性病毒。     

以neo作选择标记富集和筛选阳性重组杆状病毒

将苜蓿银纹夜蛾(AcNPV)极早期基因IEI启动子控制的neo基因表达盒插入p10型转载体pAcEP106中得到pAcPIneo,将它和野生型AcNPV DNA共转染Sf细胞得到neo^+重组病毒.因为neo基因的表达使得neo^+基因的重组病毒可以在G418的存在下复制,而野生型则不能.将共转染得到的上清液以很低的感染复数连续传代,通过G418的选择作用,使重组病毒得到富集,三代以后重组病毒比例可达90%以上,如此之高的重组比例使得重组病毒的筛选不须经空斑纯化只须有限稀释即可得到.利用杆状病毒早期基因启动子表达neo基因为用早期基因表达外源毒素基因作重组病毒杀虫剂打下了基础,同时也建立了一种简便有效的筛选、富集阳性重组病毒的方法.     

表达EB病毒主要膜蛋白gp340/220不同蛋白区段的非复制型重组痘苗病毒的构建

Epstein-Barr病毒(EBV)主要膜蛋白gp340/220,是研究EBV亚单位疫苗的主要抗原.为了更详细地研究gp340/220的免疫原性,用PCR法获得不同区段的EBV BLLF1基因,并将其克隆入表达载体pNeock11β7.5中,通过重组质粒与非复制痘苗病毒在鸡胚成纤维细胞中同源重组,获得3株表达EBV gp340/220不同区段的重组痘苗病毒.PCR和Southern blot结果证实,各个重组病毒基因组中有相应外源基因的整合.Western blot结果表明,3种重组病毒感染人源细胞后都能够稳定表达蛋白,表达蛋白均为糖蛋白.免疫荧光结果表明,3种蛋白分布在细胞的不同部位.重组痘苗病毒的成功构建为更好地研究gp340/220的免疫原性提供了实验基础.     

表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建

为研制HPV16的治疗性疫苗,首先将表达质粒pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+进行同源重组,构建了痘苗重组病毒NTVJLac.再将表达质粒pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组,构建了表达HPV16 E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定.Southern杂交显示,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入.该重组病毒在人源细胞中不复制.Western blot显示,重组病毒在人源TK-143细胞中能表达E6和E7蛋白.非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7可作为HPV16相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的实验性疫苗株.