具潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

潮霉素抗性3T3细胞的建立和鉴定

目的　建立具有潮霉素 (hygromycin)抗性的 3T3细胞系 ,用于转染目的基因 (pTRE Ins human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入 3T3细胞中 ,利用潮霉素的药物选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行PCR鉴定。结果　经 5 0 0 μg ml的潮霉素压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了潮霉素抗性的 3T3细胞 ,为进行目的基因 (pTRE Ins human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。     

G418抗性HEK293细胞的培育

目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果　经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。     

pSV—2neo和HPV—Ⅱ DNA共同转染NIH3T3细胞的结果

本实验将neo及HPV-11两种DNA共同转染NIH 3T3细胞,以G418抗生素作为选择剂,对诱导的转化灶进行筛选。同时还就G418对NIH 3T3细胞的毒性进行了观察。neo单独使用诱导的转化灶数为44.00/1×10~5;neo与HPV-11合用诱导的转化灶数为162.66/1×10~5。由neo转化的细胞含有neo基因,由neo和HPV-11转化的细胞内含有该两种基因。     

DJ-1~（L166P）与DJ-1~（M26I）基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166 P和DJ-1M26 I组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组（P〈0.05）,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞（P〈0.05）。结论 DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1^M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0.05）,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞（P〈0.05）。结论成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1 M26I的NIH3T3细胞。DJ-1 M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。     

Pmscv-Ubc9逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的：构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果：限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论：携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

Pmscv-Ubc9 逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

hEPO cDNA重组逆转录病毒的构建

通过DNA重组技术,将不含非编码区的hEPO cDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXSN, pLNCX中重组质粒转染PA317细胞后,经G418筛选,抗性克隆细胞培养上清能成功地感染NIH3T3细胞,使之在筛选培养基中形成典型的G418抗性克隆,该克隆细胞染色体中成功地整合了EPOcDNA,并且表达出有生物学活性的红细胞生成素(EPO)产物。     

干细胞3D支架的研究进展

干细胞是一类具有无限增殖潜能,可自我更新的细胞,不同的培养或诱导条件下能够分化成为不同的细胞类型。目前,随着医学治疗手段及干细胞研究的不断发展,发现干细胞可应用于很多疾病的治疗,干细胞临床应用日益广泛,逐渐成为科研工作者研究的热点。然而干细胞移植进入生物体后繁殖效率很低,无法达到需求的量,因此如何对干细胞在生物体外进行大量培养扩增、在生物体内如何更稳定地增殖分化成为迫切需要解决的难题。当前干细胞最主要的培养方法仍是2D培养,2D培养无法模拟体内的3D微环境,繁殖效率较低,正是由于2D培养局限性太多,促使国内外学者对3D培养技术和3D支架材料进行深入探索,并取得了大量成果。对3D培养技术在干细胞中的发展与应用进行概述和展望。     

EphA3基因稳定表达细胞模型的建立与分析

目的：建立稳定表达外源EphA3基因的小鼠成纤维细胞株模型,初步探讨EphA3基因表达对肿瘤发生、发展的影响。方法：通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3.1（-）/myc-his-EphA3转染NIH3T3细胞,用Western印迹确定外源EphA3基因表达;通过MTT实验、软琼脂集落形成实验,观察EphA3基因表达对NIH3T3细胞生物学特性的影响。结果：建立了稳定转染EphA3基因的NIH3T3细胞株;EphA3基因表达的小鼠成纤维NIH3T3细胞生长速度没有明显变化,但在软琼脂上锚着非依赖生长的能力加强。结论：建立了稳定表达外源EphA3基因的NIH3T3细胞株,EphA3基因稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能。     

Cell cycle parameters of 3T3 cells cultured as aggregates

Summary BALB/c 3T3 cells cultured as aggregates were examined by two independent techniques to determine whether or not cells accumulated at a specific point in the cell cycle, and if so to determine the point at which they accumulate. Replating cells onto dishes followed by pulse labeling with [³H]thymidine and autoradiography indicated that aggregate-cultured cells were in the same phase of the cell cycle as cells cultured as confluent monolayers. Flow microfluorometry confirmed that 75% of the aggregate-maintained cells were arrested in G₀ or G₁, with 25% distributed throughout the rest of the cell cycle. Labeling and mitotic indices of cells in aggregates were also consistent with about 20 to 25% of the cells being in S+G₂=M phases of the cell cycle at any time. This work was supported by PHS Grant CA20323 and NSF Grant PCM 74-15092 to H. G., who is also a Harry H. Pinney Cancer Scholar.     

逆转录病毒载体介导的LacZ基因在NIH-3T3细胞中的稳定表达

精原干细胞(SSCs)介导的转基因技术很可能成为制作转基因动物及治疗雄性不育的一条新途径。为了研究逆转录病毒载体介导法转染体外培养SSCs的可行性,用脂质体介导法将携带LacZ基因的重组逆转录病毒载体pLNCL导入包装细胞PA317,用含G418的培养液筛选得到5株稳定转染的产毒细胞。收集这些克隆的产毒上清,过滤后进行倍比稀释,用NIH-3T3细胞通过X-gal染色测定其浓缩前病毒滴度。结果显示,PA3173培养上清中病毒的浓缩前滴度最高,达1.1×103CFU/mL。再将筛选到的稳定转染的NIH-3T3细胞培养至单层,进行X-gal染色检测β-半乳糖苷酶的表达。结果显示,大多数稳定转染的NIH-3T3细胞均为X-gal ,表明这些细胞成功表达了目的基因LacZ。本研究结果为后期工作中用该载体感染体外培养SSCs奠定了基础。     

稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立及鉴定

目的构建人c-jun氨基末端激酶3（c-jun N—terminal kinase 3,JNK3）真核表达载体,并在人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）中稳定表达以探讨JNK3对细胞凋亡的影响。方法以pDBleu—JNK3为模板,PCR扩增人JNK3基因全长,目的片段亚克隆至真核表达载体pEGFP—C3,酶切及测序鉴定。Lipofeetamine^TM 2000转染SHSY5Y细胞,并通过G418选择性培养建立稳定表达JNK3的SHSY5Y细胞系,荧光垃微镜下观察细胞中JNK3表达,RT—PCR、Western印迹检测JNK3表达。结果成功构建了pEGFP—C3-JNK3真核表达载体,并建立了稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系,与对照组相比,其人JNK3基因表达明显升高。结论稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立,为进一步研究人JNK3的功能及其与细胞凋亡的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。     

14-3-3蛋白在细胞周期调节中的作用

14-3-3是一个在真核细胞中广泛表达、功能复杂的蛋白家族,主要通过磷酸化依赖的方式与靶蛋白结合,从而发挥其调控作用。细胞周期的调节对维持基因组的稳定性至关重要。近年来的研究发现,14-3—3蛋白可以和越来越多的细胞周期调节蛋白相互作用,调节G2／M期和G1／S期转换,从而对细胞周期起调控作用。简要综述了14—3—3蛋白在细胞周期调节中的作用。     

MiR-30a-3p 对人滋养肿瘤细胞系JEG-3 细胞侵袭功能的影响

目的：MiRNAs 对于胎盘的形成和正常妊娠的维持起着至关重要的作用,它在胎盘中的表达失衡的可能导致了妊娠相关疾 病的发生,我们前期研究发现miR-30a-3p 在子痫前期患者胎盘上特异性高表达,推测miR-30a-3p 可能参与了子痫前期的发生发 展过程,本课题通过观察miR-30a-3p 对人滋养肿瘤细胞系JEG-3 细胞侵袭能力的影响,深入探讨miR-30a-3p 在子痫前期发病过 程中的作用。方法：应用瞬时转染技术在人滋养肿瘤细胞系JEG-3 细胞中分别转染miR-30a-3p mimics、mimics NC为miR-30a-3p 过表达组和阴性对照组,空白转染组为空白对照组,利用荧光实时定量PCR 技术检测各组细胞中miR-30a-3p的表达,Transwell 实验检测各组细胞侵袭能力的差别。结果：荧光实时定量PCR结果显示miR-30a-3p 过表达组与阴性对照组、空白对照组相比 miR-30a-3p 的表达量明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;Transwell 实验结果显示miR-30a-3p过表达组细胞的侵袭能力与 阴性对照组、空白对照组相比均有降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组与空白对照组的侵袭能力差异无统计学意义 (P>0.05)。结论：miR-30a-3p 可以显著下调JEG-3 细胞的侵袭力, miR-30a-3p 有可能通过降低滋养细胞的浸润能力,导致滋养细胞 对子宫肌层和螺旋动脉的浸润不足,造成“胎盘浅着床”,从而在子痫前期的发病过程中发挥了重要的作用,miR-30a-3p 有望成为 诊治子痫前期疾病的靶点。     

MiR-30a-3p对人滋养肿瘤细胞系JEG-3细胞侵袭功能的影响

目的：MiRNAs对于胎盘的形成和正常妊娠的维持起着至关重要的作用,它在胎盘中的表达失衡的可能导致了妊娠相关疾病的发生,我们前期研究发现miR-30a-3p在子痫前期患者胎盘上特异性高表达,推测miR-30a-3p可能参与了子痫前期的发生发展过程,本课题通过观察miR-30a-3p对人滋养肿瘤细胞系JEG-3细胞侵袭能力的影响,深入探讨miR-30a-3p在子痫前期发病过程中的作用。方法：应用瞬时转染技术在人滋养肿瘤细胞系JEG-3细胞中分别转染miR-30a-3p mimics、mimics NC为miR-30a-3p过表达组和阴性对照组,空白转染组为空白对照组,利用荧光实时定量PCR技术检测各组细胞中miR-30a-3p的表达,Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的差别。结果：荧光实时定量PCR结果显示miR-30a-3p过表达组与阴性对照组、空白对照组相比miR-30a-3p的表达量明显升高,差异具有统计学意义（P〈0.05）;Transwell实验结果显示miR-30a-3p过表达组细胞的侵袭能力与阴性对照组、空白对照组相比均有降低,差异具有统计学意义（P〈0.05）。阴性对照组与空白对照组的侵袭能力差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：miR-30a-3p可以显著下调JEG-3细胞的侵袭力,miR-30a-3p有可能通过降低滋养细胞的浸润能力,导致滋养细胞对子宫肌层和螺旋动脉的浸润不足,造成＂胎盘浅着床＂,从而在子痫前期的发病过程中发挥了重要的作用,miR-30a-3p有望成为诊治子痫前期疾病的靶点。     

ERK3信号通路的活化阻止细胞增殖

ERK3是ERK家族中结构较为独特的成员,尤其在分子生物学特征上与ERK家族其他成员明显不同,如基因结构中外显子之间的大内含子、蛋白质结构中活化环的丝氨酸单磷酸化位点以及激酶C端的延伸序列等.ERK3具有独特的丝氨酸单磷酸化位点,导致所有以苏氨酸/酪氨酸双磷酸化位点为磷酸化靶点的MEK分子均不能活化ERK3.ERK3的C端延伸序列能与细胞周期蛋白D3结合并调控ERK3的亚细胞定位,从而影响ERK3对细胞周期的调节.据目前文献推测,ERK3调控细胞周期的信号通路可能为:Ras→B-Raf→ERK3激酶→ERK3→G1期CDK复合物减少→S期抑制因子增多→细胞增殖阻滞于S期→细胞停止增殖,进入分化.此外,ERK3信号通路的活化与细胞分化、胚胎发育、胰岛素分泌以及肿瘤的发生密切相关.     

Nanos3与生殖细胞发育分化

小鼠Nanos3基因是果蝇Nanos的同源基因,是Nanos基因家族的一员. Nanos3是一种RNA结合蛋白,靠近其C端有两个非常保守且连续的Cys-Cys-His-Cys特异锌指结构域.研究显 示,Nanos3在小鼠生殖细胞中特异表达,不仅在原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）的维持方面发挥重要作用,而且是一种启动雄性生殖细胞分化程序的内源性因子, 其在精子发生中的重要作用已引起越来越多的关注.探讨Nanos3的生物学功能,有助于了解生殖细胞发育过程中的部分重要机制.本文就Nanos3维持生殖细胞更新和原始生殖细胞的 维持等作用作一综述.