Pmscv-Ubc9 逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

Mo MLV gag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定

目的 构建含MoMLV gag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法 应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明, gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kD)为194.78×103。然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果 酶切鉴定的片段大小分别为5.2-kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kD)为194.78×103,与预期相符。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒。结论 本工作构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。     

用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中,构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA—MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞,并用G418筛选产生稳定的细胞克隆,用RT—PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确,逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆,RT—PCR和Western印迹检测人MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MCPHI基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPHImRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

重组anti－CD20 scFv／CD80／CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建及其在Jurkat细胞株中的表达

目的:构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒,转染Jurkat细胞株使其表达目的蛋白.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,收获上清液获非复制型逆转录病毒,感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞的表达情况,确定病毒滴度.挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞,用RT-PCR检测目的基因表达情况.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建; 用PCR能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段; 流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白; 经RT-PCR,能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白.     

人神经营养因子-3重组逆转录病毒的包装与鉴定

在逆转录病毒载体pLXSN中引入人神经营养因子-3(hNT-3),构建成重组质粒pLXSN-NT3,转染包装细胞PA317后经G418筛选得到几个稳定产毒的细胞克隆.测定这几个克隆的病毒滴度,最高达到1.60×105,且产毒细胞株不产生复制型病毒.PCR和大乳鼠背根神经节活性检测证明hNT-3已整合到宿主细胞基因组并能稳定表达.     

逆转录病毒载体介导的LacZ基因在NIH-3T3细胞中的稳定表达

精原干细胞(SSCs)介导的转基因技术很可能成为制作转基因动物及治疗雄性不育的一条新途径。为了研究逆转录病毒载体介导法转染体外培养SSCs的可行性,用脂质体介导法将携带LacZ基因的重组逆转录病毒载体pLNCL导入包装细胞PA317,用含G418的培养液筛选得到5株稳定转染的产毒细胞。收集这些克隆的产毒上清,过滤后进行倍比稀释,用NIH-3T3细胞通过X-gal染色测定其浓缩前病毒滴度。结果显示,PA3173培养上清中病毒的浓缩前滴度最高,达1.1×103CFU/mL。再将筛选到的稳定转染的NIH-3T3细胞培养至单层,进行X-gal染色检测β-半乳糖苷酶的表达。结果显示,大多数稳定转染的NIH-3T3细胞均为X-gal ,表明这些细胞成功表达了目的基因LacZ。本研究结果为后期工作中用该载体感染体外培养SSCs奠定了基础。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

人神经营养因子-3重组逆转录病毒的包装与鉴定

逆转录病毒载体pLXSN中引入人神经营养因子-3(hNT-3),构建成重组质粒pLXSN-NT3,转染包装细胞PA317后经G418筛选得到几个稳定产毒的细胞克隆。测定这几个克隆的病毒滴度,最高达到1.60×10⁵,且产毒细胞株不产生复制型病毒。PCR和大乳鼠背根神经节活性检测证明hNT-3已整合到宿主细胞基因组并能稳定表达。     

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。     

牛sox2基因的克隆及重组反转录病毒载体的构建

为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体,获得有感染性的病毒颗粒,本研究以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列,将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2基因序列(Gen Bank Accession No.NM-001105463)高度同源;将测序正确的重组T载体用EcoRI和BglII酶切,基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo的相同酶切位点,成功构建了重组反转录病毒载体pMSCV-sox2。采用脂质体法用pMSCV-sox2转染包装细胞PT67,同时用pMIG(含绿色荧光蛋白)作为阳性对照,经流式细胞仪测定,该载体转染效率达到68.3%;转染后PT67细胞经G418筛选得到稳定的产毒细胞株,其病毒滴度达8.16×107CFU/mL,为下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。     

人神经元素3基因重组逆转录病毒表达载体的构建及其包装细胞株的建立

为构建表达人神经元素3基因(neurogenin 3,ngn3)的重组逆转录病毒载体,建立稳定表达ngn3的包装细胞株,本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料,通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因,将其连接到pMD18-T载体上并测序,结果表明,测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列(GenBank Accession No.BC126468)完全一致。将EcoRI和HpaI双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中,酶切鉴定结果表明,pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将pMSCV-ngn3重组载体导入PT67包装细胞,G418筛选后,对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测,结果显示,该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3;收集该细胞株的培养上清液,进行RT-PCR检测及电镜观察,结果表明,该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒,并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立,为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。     

EGFP—pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的EGFP—pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定。方法从pEGFP—N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP—pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到Fr67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功构建EGFP—pBABE重组质粒。该质粒转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达。结论成功构建表达EGFP的EGFP—pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础。     

14-3-3σ干扰逆转录病毒载体的构建及其稳定转染HaCat细胞系的建立

目的：构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立稳定转染的HaCat细胞系。方法：人工合成14-3-3σ基因干扰序列并定向插入到pSuper-retro-neo-EGFP质粒,并在STBL3菌内进行质粒扩增,刷选阳性克隆,酶切测序鉴定,转染293FT细胞进行病毒包装、扩增、纯化、获取逆转录病毒载体,将逆转录病毒载体感染HaCat细胞后Western免疫印迹法、Real-timePCR法检测14-3-3σ的表达情况。结果：连接重组后经酶切和测序筛选出pSuper-retro-neo-EGFP-si14-3-3σ;干扰质粒稳定转染的HaCat细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光,Western免疫印迹法和Real-timePCR法表明14-3-3σ表达明显抑制。结论：成功构建了14-3-3σ干扰的逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系。     

携带HSV-1TK基因的逆转录病毒载体构建及在HeLa细胞中的表达

目的:构建携带单纯疱疹病毒脱氧胸腺嘧啶激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究。方法:用限制性内切酶从质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-TK切下HSV-1TK cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN得到重组质粒pLXSN-TK,鉴定正确的阳性重组质粒经PA317细胞包装,G418筛选,在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定。然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa。PCR、RT-PCR和Western blotting方法检测HSV-1TK基因在HeLa中的整合和表达情况。结果:重组质粒pLXSN-TK经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现HSV-1TK基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录和翻译。结论:成功构建了逆转录病毒pLXSN-TK,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的治疗基因HSV-1TK在细胞中表达,为今后HSV-1TK基因治疗宫颈癌的研究奠定基础。     

LMO3逆转录病毒表达载体的构建及其对SK-N-AS细胞增殖的影响

目的构建包含LM03（LIM-only3,LM03）全长基因的逆转录病毒表达载体,感染人神经母细胞瘤SK-N-AS,检测LM03对SK-N-AS细胞增殖的影响。方法将质粒pEGFP-Cl-一LM03经EcoRI和BamHI双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3,导人包装细胞pA317,获得逆转录病毒颗粒,感染SK-N-AS细胞,用RT-PCR及Western印迹鉴定,检测LM03感染后细胞的增殖及细胞周期分布情况。结果获得了能正确表达LM03基因的重组逆转录病毒表达载体pLX-SN-LMO3;LM03基因被逆转录病毒成功导入SK-N-AS细胞后,与对照组细胞相比,LM03感染组G1／G1期细胞减少,S期细胞增加,感染48h后,LM03感染组细胞的增殖能力显著高于空载体对照组及SK-N．AS组（P〈0．05）。结论成功构建了LM03基因的逆转录病毒表达载体,LMO3可以通过促进SK-N-AS细胞由G0／G1期进入S期,从而促进细胞的增殖。     

Highly efficient gene transfer into antigen-specific primary mouse lymphocytes with replication-deficient retrovirus expressing the 10A1 envelope protein

Background

Introduction of recombinant genes in the genome of primary lymphocytes by virtue of a replication‐deficient retrovirus can be used in immunological studies and for cell‐based gene therapy.

Methods

Packaging cells GP+E86 producing replication‐deficient retrovirus incorporating the genes of enhanced green fluorescent protein (eGFP), C2γ or C2ξ, were generated by calcium phosphate‐mediated transfection. Clones with the highest titres of retrovirus vector were isolated from them and their supernatants were used for transduction of PT67 cells. Primary mouse lymphocytes and T‐cell hybridoma MD.45 were transduced by centrifugation with retroviral stock. The retroviral content of packaging cell supernatants was determined by dot blotting and hybridization with a DNA probe.

Results

PT67 cells produced ～50 times more retrovirus vector than the original GP+E86 clones. When retroviral stocks of PT67 and GP+E86 cells were used at 1/50 dilution and undiluted, respectively (to normalize them forretroviral RNA content), the transduction efficiency of mouse T‐cell hybridoma was 40% and 5%, respectively. Centrifugation of target cells with retroviral stock at 2000 g for 60 min increased the percentage of transduced cells two‐ to three‐fold. Within a population of cells isolated from the draining lymph nodes of an immunized mouse and reactivated with an antigen, up to 60% of CD4⁺ T cells and up to 80% of B cells could be transduced with a transgene in replication‐deficient retrovirus packaged by PT67 cells using the optimized gene transfer protocol.

Conclusions

This protocol allows for the generation of packaging cells producing high titres of retrovirus vector. The 10A1 envelope protein is superior to the ecotropic one for the transduction of mouse lymphocytes. Copyright © 2002 John Wiley & Sons, Ltd.

     

骨形成蛋白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡

目的 构建表达重组人骨形成蛋白7 （bone morphogenic protein 7, BMP7）基因的重组逆转录病毒,观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性,并探讨其作用机制。方法 克隆BMP7基因,以loxP同源重组法构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP7（pLLBMP7）,转染包装细胞PT67进行病毒包装并测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,MTT法检测细胞生长变化,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;Western blotting检测BMP7,caspase-3和bcl-2蛋白表达。结果 重组逆转录病毒载体pLLBMP7经鉴定连接正确,转染PT67细胞后上清液中可得到病毒,滴度达1×109pfu;MTT检测见pLLBMP7病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（35.1% vs. 5.3%,68.5% vs.18.3%,均p<0.05）,48h可见BMP7蛋白高表达。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,于转染48h后达最高峰,其凋亡百分率高达14.42%;BMP7蛋白高表达时caspase-3蛋白的表达亦有显著升高,但bcl-2蛋白未见表达差异。结论 构建了BMP7逆转录病毒,在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡,其可能是通过激活caspase-3而发生作用。