含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及表达

利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人ＴＮＦ－α及ＩＬ－２ｃＤＮＡ和选择基因新霉素磷酸转移酶基因（ＮｅｏＲ）,使ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将这３个基因转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成含人ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因多顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＲＩ。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株,经ＰＣＲ证明外源基因已整合至基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,Ｇ４１８筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达ＴＮＦ－α及ＩＬ－２。实验结果表明,含ＩＲＥＳ的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。     

人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体的构建及其在成纤维细胞中的表达

利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ和选择基因ＮｅｏＲ基因,使ＴＮＦ－α及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将两基因同时转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成人ＴＮＦ－α双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＮＦ－α．在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株．经ＰＣＲ证明外源基因已整合至细胞基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一ＬＲＴ转录本．持续Ｇ４１８筛选能明显促进目的基因ＴＮＦ－α的表达．用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３,Ｇ４１８筛选获得的混合抗性克隆持续高表达ＴＮＦ－α,４０Ｇｙγ线照射后能维持高效表达至７ｄ．实验结果表明,含ＩＲＥＳ的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体．     

细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定

从人外周血单核细胞中抽提总ＲＮＡ为模板,分别用５‘含ＥｃｏＲⅠ３含ＢａｍＨＩ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物成含信号肽全长ＩＬ－２,γ－ＩＦＮ及α－ＴＮＦｃＤＮＡ。然后将这些细胞因子ｃＤＮＡ分别重组入含筛选标记基因Ｎｅｏ逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中,采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系ＰＡ３１７。分别收集到含ＩＦＮ－γ,ＴＮＦ－α和ＩＬ－２基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒ｐＬＸＳ     

bcl—2和IL—1和TNFα表达的调节作用初探

通过将反义ｂｃｌ－２基因转梁于Ｕ９３７细胞,建立了Ｂｃｌ－２蛋白表达受抑的Ｕ９３７细胞模型,证实了模型细胞的增殖和存活表型授课和线菌素Ｄ－结晶紫试验和ＥＬＩＳＡ检测表明模型细胞上清中ＴＮＦα的活性和含量无明显变化,小鼠胸腺细胞增殖试验表明模型细胞上清中ＩＬ－１活性升高,提示ｂｃｌ－２的表达对ＴＮＦα的表达无明显影响,但可能在一定程度上抑制了ＩＬ－１的表达或活性。     

青春双歧杆菌DM8504菌株对小鼠体内HCa—F25／16A3—F肿瘤细胞 …

本实验应用加热处死的青春双歧杆菌ＤＭ８５０４菌株皮下注射荷瘤ＨＣａ－Ｆ２５／１６Ａ３－Ｆ肿瘤的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,酶联法测定小鼠体内ＴＮＦ－α、ＩＬ－６的含量,ＴＵＮＥＬ法及电镜观察肿瘤组织中是否有凋亡细胞的存在。实验结果指出：双歧杆菌能提高荷瘤小鼠体内ＴＮＦ－２的含量,较对照组明显升高,但ＩＬ－６的含量处理组与对照组之间无显著性差异。ＴＵＮＥＬ法除观察到不同程度的坏死组织外,未见到散在凋亡的肿瘤细     

单核／巨噬细胞分泌TNF—α的调控及在老年时的改变

肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）是一种主要由单核／巨噬细胞分泌的细胞因子。它不仅有杀伤肿瘤细胞的特性,还在炎症、休克和自身免疫等病理过程中起重要作用。刺激巨噬细胞分泌ＴＮＦ－α的主要物质有内毒素、病毒、某些细胞因子和有丝分裂原以及神经肽等。而前列腺素Ｅ（ＰＧＥ）、ｃＡＭＰ类似物和肾上腺素类等可抑制其分泌。很多文献报道ＴＮＦ－α在老年时单核／巨噬细胞的分泌有改变。     

细胞信号转导分子在TNF—α诱导c—jun基因表达中的作用

前期研究表明ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）通过磷酸化心肌细胞增强因子２（ｍｙｏｃｙｔｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ２,ＭＥＦ２）转录因子家族成员调节ｃ－Ｊｕｎ蛋白表达。ｃ－ｊｕｎ的启动子区存在ＭＥＦ２位点,ＭＥＦ２转录因子家族成员以同源或异源二聚体形式与其结合。研究了ｐ３８和ＢＭＫ１（ｂｉｇ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ１）在ＴＮＦ－α诱导ｃ－ｊｕｎ基因表达中的调控作用。ｐ３８上调ＭＥＦ２Ａ的转     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

老年大鼠单核／巨噬细胞分泌和表达肿瘤坏死因子增多

为研究老年时肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）分泌及表达的改变,在内毒素（ＬＰＳ）１．０μｇ／ｍｌ刺激大鼠单核／巨噬细胞后,用酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）测定培养液中ＴＮＦ－α含量,用半定量逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＫ）测定ＴＮＦ－αｍＲＮＡ。同时测定培养液中一氧化氮（ＮＯ）和前列腺素Ｉ２（ＰＧＩ２）的含量。结果显示：老年鼠ＴＮＦ－α分泌量及其ｍＲ－ＮＡ明显高于青年鼠。ＮＯ产量在老年鼠与青年鼠之间无明显差异。老年鼠ＰＧＩ２分泌明显低于青年鼠。由于ＰＧ能抑制ＴＮＦ－α释放,从而推测,ＰＧＩ２产生能力的降低可能是老年大鼠单核／巨噬细胞ＴＮＦ－α分泌量明显高于青年鼠的原因之一。     

动脉平滑肌细胞sis／PDGF—B链的表达和调控

介绍平滑肌细胞ｓｉｓ／ＰＤＧＦ－Ｂ链表达和调控的进展。ｃ－ｓｉｓ原癌基因是ＰＤＧＦ－Ｂ的同源基因,将外源的ＰＤＧＦ基因导入哺乳类细胞是研究ＰＤＧＦ功能和调控的重要手段。内皮素ＩＬ、ＴＮＦ、血管紧张素Ⅱ和蛋白激酶Ｃ可调节ｓｉｓ基因的表达。ｓｕｒａｍｉｎ和新霉素的人工合成为拮抗ＰＤＧＦ效应提供广阔的前景。ｃ－ｓｉｓ可通过激活ｃ－ｍｙｃ,ｃ－ｆｏｓ等原癌基因而促进细胞增殖。     

肿瘤坏死因子－α（TNF－α）对常见呼吸道病毒的抑制作用

用人重组肿瘤坏死因子－α（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α,ＴＮＦ－α）和人天然α干扰素（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α－,ＩＦＮ－α）在人胚胎肺纤维母细胞（ＨＥＦ）和Ｈｅｐ－２细胞系上对常见呼吸道病毒所致细胞病变抑制进行比较观察。病毒包括不同型别的腺病毒５株,单疱病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－Ｉ）１株,鼻病毒１株,仙台病毒１株,ＶＳＶ１株。结果提示ＴＮＦ－α和ＩＦＮ－α均具有广谱抗病毒活性。ＴＮＦ－α的抑毒作用能被ＴＮＦ－α申抗和ＩＦＮ－β单抗完全去除,被ＩＦＮ－α单抗部分去除ＴＮＦ－α的抗病毒效应。ＴＮＦ－－α中和试验的结果提示：ＴＮＦ抗病毒活性仍为ＩＦＮ－β诱生所介导。     

巨噬细胞,细胞因子与人类免疫缺陷病毒

单核－巨噬细胞是人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）感染的主要靶细胞之一。本文概述了ＨＩＶ感染后,体内外细胞因子的产生情况,各种细胞因子如ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－α、转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）和ＴＮＦ－α等对ＨＩＶ在巨噬细胞中表达的调控及影响ＨＩＶ表达的机制,并对今后的研究方向进行了展望。     

前列腺素对肺泡巨噬细胞分泌白细胞介素—8的调控

本实验在经血清调理酵母聚糖激活的大鼠肺泡巨噬细胞（ＡＭ）体外培养４ｈ后,检测其上清液中的ＰＧｓ含量。消炎痛预处理使激活的ＡＭ释放的ＰＧＥ１、Ｅ２、Ｆ２ａ量显著减少,Ｅ２／Ｅ１和Ｅ２／Ｆ２ａ比值降低;而细胞松弛素Ｂ预处理ＡＭ则可使上述ＰＧｓ的含量增加。以中性粒细胞趋化指数来反映ＩＬ－８的活性,表明消炎痛预处理ＡＭ组的ＩＬ－８的分泌量显著减少,而细胞松弛素Ｂ预处理ＡＭ组的ＩＬ－８分泌量显著增多。ＡＭ的     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

创伤后巨噬细胞对T细胞白介素2及白介素2受体α基因表达的直…

以２５μｇ／ｍｌ的丝裂霉素Ｃ处理巨噬细胞３０ｍｉｎ,可阻断巨噬细胞白介素１（ＩＬ－１）、白介素６（ＩＬ－６）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）及前列腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）的合成与分泌。创伤小鼠巨噬细胞经丝裂霉素Ｃ处理后,可明显抑制正常Ｔ细胞白介素２（ＩＬ－２）ｍＲＮＡ及ＩＬ－２受体（ＩＬ－２Ｒ）α ｍＲＮＡ水平,并增强Ｔｓ细胞的抑制活性。去除Ｔ细胞中Ｔｓ细胞可使巨噬细胞的抑制作用消失。表明创伤后巨噬细胞可通过     

白细胞介素—2—绿脓杆菌外毒素融合蛋白的分高纯化及其复性研究

表达的白细胞介素－２－绿脓杆菌外毒素（ＩＬ－２－ＰＥ）融合蛋白以包含体形式存在于宿主菌中,为分离纯化表达产物提供了方便,但因需进行复性,也增加了后处理的难度．我们采用４ｍｏｌ／Ｌ尿素、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的１×ＰＢＳ洗涤包含体两遍,再经ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００分子筛及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阴离子交换柱层析后,获得的融合蛋白纯度可达９０％～９５％。此外,我们从ＧＳＳＧ浓度、Ｌ－精氨酸浓度、复性蛋白质的起始浓度、复性液的ｐＨ值、复性温度及复性时间等参数入手,系统地研究了融合蛋白的复性条件,探索到了ＩＬ－２－ＭＥ４０和ＩＬ－２－ＰＥ６６４Ｇｌｕ融合蛋白复性的最适条件。     

重组人白细胞介素—6与肿瘤坏死因子突变体融合蛋白的构建及表达

针对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上的白细胞介素－６（ＩＬ－６）受体明显增高的事实,根据ＴＮＦ结构与功能研究的最新信息,利用ＰＣＲ技术,对人ＴＮＦα基因进行了改造,并将共与ＩＬ－６成熟肽编码区ｃＤＮＡ通过人工接头进行融合,融合蛋白在大肠杆菌表达后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,分子量约为３７ｋＤ,活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有ＴＮＦ抗肿瘤活性和结合ＩＬ     

Bcl——2基因表达对TNF及OA诱发的细胞编程死亡的不同效应

用ＴＮＦ和ＯＡ（Ｏｋａｄａｉｃａｃｉｄ）诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞死亡,并证明细胞死亡为编程死亡（ＰｒｏｇｒｍｍｅｄＣｅｌｌＤｅａｔｈ,简称ＰＣＤ）。将编码Ｂｃｌ－２全长蛋白的ｃＤＮＡ植入ＰＪＸ４１ｎｅｏ载体中,使其表达由ＨＣＭＶ病毒起动子控制。形成的顺义（ｐＢｃｌ－２－Ｓ）及反义（ｐＢｃｌ－２－ＡＳ）表达质粒经转染导入ＳＫ细胞中获得稳定转染子。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明顺义转染子表达大量的２６ｋｄＢｃｌ－２蛋白,而反义转染子则不表达。增强表达的Ｂｃｌ－２蛋白能抑制由ＴＮＦ引发的ＰＣＤ,但不影响ＯＡ引发的ＰＣＤ,从而证明了Ｂｃｌ－２基因产物抗细胞死亡效应的特异性。     

牙龈卟啉菌脂多糖诱生的IL—1,TNF和PGE的骨吸收活性

牙龈卟啉菌脂多糖（Ｐｇ－ＬＰＳ）作用于人外周血单个核细胞或人牙龈组织细胞后,能诱导此等细胞分别产生ＩＬ－１、ＴＮＦ和ＰＧＥ。经原子吸收光谱分析后证实,所诱生的ＩＬ－１、ＴＮＦ和ＰＧＥ均具有使大鼠头盖骨脱钙的作用,消炎痛未能阻断该骨吸收活性。ＰＧＥ的骨吸收活性最强,ＩＬ－１和ＴＮＦ的骨吸收活性相似。Ｐｇ－ＬＰＳ也能直接作用于大鼠头盖骨,使钙离子释放量明显增加,但该活性能被消炎痛所阻断。研究结果表明,Ｐｇ－ＬＰＳ可直接或间接地通过ＩＬ－１、ＴＮＦ和ＰＧＥ等发挥强大的骨吸收作用,故Ｐｇ－ＬＰＳ是牙周炎时牙槽骨吸收的主要因素之一     

hEGF和hTGF—αN结构域与C结构域的功能差异

用ＰＣＲ的方法将人表皮生长因子和人转化生长因子－α（ｈＴＧＦ－α）的Ｎ结构域和Ｃ结构域互换,构造了两个嵌合分子Ｅ－ＴＧＦ（ＥＧＦ１－３２－ＴＧＦ－α３４－５０）和Ｔ－ＥＧＦ（ＴＧＦ－α１－３３－ＥＧＦ３３－５３）。野生型和嵌合分子基因在大肠杆菌ｐｈｏＡ系统表达并纯化定量。各重组体的受体竞争结合活性大小为ｈＥＧＦ〉ｈＴＧＦ－α和Ｅ－ＴＧＦ〉Ｔ０－ＥＧＦ,它们的促细胞生长活性的大小为ｈＴＧＦ－α和Ｅ－