甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

将来自枯草芽孢杆菌的碱性脂肪酶基因经密码子优化,全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了pPICZαA-bsl分泌型重组质粒,该重组质粒经限制性内切酶PmeI线性化后使用LiCl法转化到毕赤酵母X-33,经过筛选获得分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-bsl。摇瓶发酵液上清酶活最高可达4.78 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为40-60℃,最适pH9.0,且具有高度耐碱的特性。该重组脂肪酶对旧新闻纸具备较明显的脱墨能力。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

两拷贝β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

目的:旨在获得高效分泌表达的两拷贝β-甘露聚糖酶(β-mannase)毕赤酵母工程菌株。方法:以作者研究室保藏的黑曲霉β-mannase X33菌株(X33-β-mannase)为出发菌株,体外构建两拷贝重组质粒pPIC-mannase,用电击法转化至X33感受态细胞,用抗生素Zeocin筛选阳性转化子,用BMGY培养基培养,BMMY诱导其表达,利用DNS法测定酶活。结果:实验已成功构建了两拷贝β-mannase毕赤酵母工程菌株,50 L发酵罐培养7 d后,β-mannase产酶水平达到21 300 U/ml。     

枯草芽孢杆菌群β-甘露聚糖酶基因克隆及同源性分析

本文对33株枯草芽孢杆菌群菌株进行β-甘露聚糖酶活性筛选,其中的32株具有β-甘露聚糖酶活性,只有1株无β-甘露聚糖酶活性.通过基因克隆测序的方法获得33株枯草芽孢杆菌群菌株β-甘露聚糖酶基因编码区全序列,对酶基因进行同源性分析并构建系统发育树;在β-甘露聚糖酶基因系统发育树中,33株枯草芽孢杆菌群菌株聚为3个分支,分别是枯草芽孢杆菌分支、地衣芽孢杆菌分支和解淀粉芽孢杆菌分支;枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因种内同源性大于91%,而种间同源性为60%69%.     

共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

为了改善高密度发酵生产β-甘露聚糖酶过程中的溶氧限制,提高β-甘露聚糖酶产量,将VHb和β-甘露聚糖酶基因置于AOX1启动子调控之下,进行VHb和β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达。经密码子优化合成VHb基因,插入表达载体p PICZαA,整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,通过G418和Zeocin抗性筛选共表达VHb基因的重组酵母工程菌。在30 L发酵罐水平上分析共表达VHb菌株(VHb+)与初始菌株(VHb-)对β-甘露聚糖酶表达的差异。结果显示,限氧条件下,VHb+菌株的β-甘露聚糖酶的表达量比对照菌株VH b-高90%,且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性,缩短发酵周期约40 h。     

碱性β-甘露聚糖酶基因异源表达的研究

亚克隆的碱性β-甘露聚糖酶基因(man)来源于嗜碱芽孢杆菌N16-5,构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌诱导型表达质粒pDG-man,在大肠杆菌JM109中获得了活性表达,经0.5 mmol/L的IPTG诱导后,可表达5 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。重组大肠杆菌DE3-RIL(pDG-man)表达β-甘露聚糖酶水平是大肠杆菌JM109(pDG-man)的2倍。重组枯草芽孢杆菌WB600(pDG-man)可表达19.2 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

一株全基因合成耐热甘露聚糖酶的表达及酶学性质分析

根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列与毕赤酵母密码子使用偏爱性,设计并合成了甘露聚糖酶ManA全基因(Accession No.KJ806637),与表达载体pPIC9k重组后,转化毕赤酵母GS115,筛选获得重组菌株ManA-GS115。该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定,其中甘露聚糖酶ManA含量达到电泳纯级别,分子量大小约为30 kDa。其酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为6.0,比活力高达3200 IU/mg,并且在75℃下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManA表达量较高,在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力,且热稳定性显著,可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。     

一株全基因合成耐热甘露聚糖酶的表达及酶学性质分析

根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列与毕赤酵母密码子使用偏爱性,设计并合成了甘露聚糖酶ManA全基因(Accession No.KJ806637),与表达载体pPIC9k重组后,转化毕赤酵母GS115,筛选获得重组菌株ManA-GS115。该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定,其中甘露聚糖酶ManA含量达到电泳纯级别,分子量大小约为30 kDa。其酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为6.0,比活力高达3200 IU/mg,并且在75℃下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManA表达量较高,在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力,且热稳定性显著,可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。     

芽胞杆菌β-甘露聚糖酶基因部分序列的克隆及相似性分析

通过平板筛选,从28株芽孢杆菌中筛选出16株产β-甘露聚糖酶的菌株。利用一对兼并引物,通过PCR分别从不同来源芽孢杆菌基因组DNA上扩增出β-甘露聚糖酶编码基因的一段保守序列。将基因片段测序并同已发表的β-甘露聚糖酶基因进行相似性分析,并构建进化树。结果表明:克隆到的β-甘露聚糖酶部分基因序列与报道的相比,其最高同源性在62%～98%之间。环形芽孢杆菌β-甘露聚糖酶编码基因间相似性较低,枯草芽孢杆菌及其它芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶编码基因间相似性较高。     

短小芽孢杆菌β-1，4-甘露聚糖酶的酶学性质及其在干酪乳杆菌中的表达

摘要:【目的】干酪乳杆菌广泛的应用于食品加工和饲料行业,本研究拟构建表达甘露聚糖酶的重组干酪乳杆菌并进行相关评价。【方法】利用干酪乳杆菌表达载体pELX1和pELSH,将短小芽孢杆菌的β-1,4-甘露聚糖酶成熟肽的基因克隆到上述两个载体中,构建的重组质粒电转化到干酪乳杆菌宿主中,分别构建能够胞内表达和分泌表达甘露聚糖酶的重组干酪乳杆菌。【结果】重组干酪乳杆菌菌株经培养后,胞内表达的β-1,4-甘露聚糖酶在重组细胞总蛋白中最高可达23 U/mg,分泌表达培养基上清的β-1,4-甘露聚糖酶最高达到8.8 U/mL。【结论】本研究首次实现了甘露聚糖酶在干酪乳杆菌中的表达,结果表明该重组干酪乳杆菌具有较大的应用前景,值得进一步研究。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组分分析

对来源于枯草芽孢杆菌菌株168(Bacillus subtilis 168)的壳聚糖酶编码基因进行了序列优化及全合成,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中实现了分泌表达,表达产物的蛋白质浓度达到0.30mg/ml。表达的壳聚糖酶最适p H为5.6,最适温度为55℃,比酶活达84.54U/ml。该酶在50℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)对产物的组分进行了分离及鉴定。根据一级质谱信息,推测酶解产物中包含至少37种聚合度2~18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分。综上,利用毕赤酵母分泌表达了来源于枯草芽孢杆菌菌株168的壳聚糖酶基因,利用表达产物水解制备了低脱乙酰度壳寡糖并对其组分进行了分析,可为后续壳寡糖结构与功能关系的研究提供参考。     

枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶固体发酵条件的优化*

芽孢杆菌是产甘露聚糖酶的优良菌株,首次研究芽孢杆菌固体发酵条件的优化。以天然麸皮作为基本原料,研究利用枯草芽孢杆菌WY34固体发酵生产β-甘露聚糖酶的发酵条件。最佳固体发酵培养条件为:麸皮5 g,初始水分含量71%,初始pH 7.0,接种量为2 mL,1%Tween-80,0.4 g魔芋粉,培养温度50℃。在最适条件下培养5 d,甘露聚糖酶酶活高达7,650 U/g干基,是未优化前酶活的2.78倍。     

超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。     

RT-PCR检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数

利用荧光定量PCR方法检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因(man)拷贝数。以毕赤酵母中高度保守基因三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gap)为内参基因,分别构建含有gap和man的克隆质粒,进行RT-PCR反应构建gap和man双标准曲线;获得的双标准曲线具有良好的重复性,其相关系数(R2)均为0.999,其扩增效率分别为105.1%和102.2%。提取含有外源man基因的毕赤酵母基因组进行RT-PCR检测,通过双标准曲线计算出外源man基因的拷贝数。结果显示:预先经过博莱霉素(Zeoicn)抗性筛选得到的10株毕赤酵母重组菌株中含有1、2、3、4、5和7个不等拷贝的β-甘露聚糖酶基因。结果表明该方法能够高效快速筛选和鉴定出含有不同外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株。     

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶固体发酵条件的优化

芽孢杆菌是产甘露聚糖酶的优良菌株,首次研究芽孢杆菌固体发酵条件的优化。以天然麸皮作为基本原料,研究利用枯草芽孢杆菌WY34固体发酵生产β-片露聚糖酶的发酵条件。最佳固体发酵培养条件为：麸皮5g,初始水分含量71％,初始pH7．0,接种量为2mL,1％Tween-80,0.4g魔芋粉,培养温度50℃。在最适条件下培养5d,甘露聚糖酶酶活高达7,650U／g干基,是未优化前酶活的2．78倍。