产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选

从多种来源筛选高产鼠李糖脂的菌株,并研究菌种发酵特性和鼠李糖脂产物的理化性质。采用CTAB平板初步筛选鼠李糖脂合成菌株,通过分析菌株的16S r RNA基因序列确定细菌种属,采用薄层色谱、红外光谱分析产物性质。结果显示,利用CTAB平板初筛获得163株阳性菌株,初步发酵确定10株高产细菌鼠李糖脂的产量为12.2-17.7 g/L,10株细菌均鉴定为铜绿假单胞菌。挑选产量最高的菌株B12,分别以甘油、菜籽油、花生饼粉或葵花籽饼粉为碳源进行发酵,发现菜籽油为合成鼠李糖脂的最佳碳源。进一步对比在35℃、37℃和40℃的发酵水平,发现37℃条件下鼠李糖脂产量最高,为26.8 g/L。最后,对鼠李糖脂发酵产物进行了初步纯化,并进行了薄层色谱和红外光谱分析。菌株B12能够合成较高水平的鼠李糖脂,可能成为工业生产的候选菌株。     

铜绿假单胞菌中鼠李糖脂生物合成的研究进展*

鼠李糖脂因其具有环境友好和卓越的物理化学特性,而有望成为化学合成表面活性剂的替代物。近年来鼠李糖脂得到了广泛的研究,其目的是利用低价的可再生资源进行大规模生产,但目前的研究成果仍不足以选育出更具商业竞争力的鼠李糖脂过量合成菌株。为此,进一步理解鼠李糖脂生物合成的复杂基因调控网络,探索降低生产成本的发酵工艺势在必行。综述了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂的生物合成途径、群体感应对主要基因的调控、鼠李糖脂在生物膜形成中所发挥的作用,以及发酵优化对鼠李糖脂产量的影响。有助于加深对鼠李糖脂生物合成的认识,为提高鼠李糖脂产量提供重要参考信息。     

铜绿假单胞菌中鼠李糖脂生物合成的研究进展*

鼠李糖脂因其具有环境友好和卓越的物理化学特性,而有望成为化学合成表面活性剂的替代物。近年来鼠李糖脂得到了广泛的研究,其目的是利用低价的可再生资源进行大规模生产,但目前的研究成果仍不足以选育出更具商业竞争力的鼠李糖脂过量合成菌株。为此,进一步理解鼠李糖脂生物合成的复杂基因调控网络,探索降低生产成本的发酵工艺势在必行。综述了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂的生物合成途径、群体感应对主要基因的调控、鼠李糖脂在生物膜形成中所发挥的作用,以及发酵优化对鼠李糖脂产量的影响。有助于加深对鼠李糖脂生物合成的认识,为提高鼠李糖脂产量提供重要参考信息。     

基因工程微生物合成鼠李糖脂表面活性剂的研究进展

鼠李糖脂是一类重要的生物表面活性剂。相比于化学合成的表面活性剂,其具有更优秀的理化性质及环境友好等特点,被广泛应用于微生物采油、环境污染修复等工程中。目前,鼠李糖脂的工业生产主要采用铜绿假单胞菌这一具有致病性的天然合成菌株,与此同时,受菌株遗传背景的限制,优化发酵过程等方法在产量提升方面遇到了一些瓶颈问题。利用基因工程方法对菌株进行改良有望进一步提高鼠李糖脂生产的安全性、产量、产物性能等多项指标,因此受到了越来越广泛的关注。本文综述了近年来利用基因工程方法优化鼠李糖脂生物合成的最新进展,讨论了异源合成、代谢通路改造、基因表达优化、蛋白质工程、底盘工程等多种策略的应用,并展望了一系列可行的研究方向。     

铜绿假单胞菌对长链烷烃的摄取模式*

研究了一株铜绿假单胞菌(CGMCC 1.1785)摄取长链烷烃的模式。铜绿假单胞菌1.1785能够以固态的长链烷烃为唯一碳源生长,在培养过程中产生表面活性代谢物。烃与水相的界面面积是细菌生长重要的影响因素,说明传质限制的存在。由于该菌不能够利用鼠李糖脂增溶的烃作为碳源,因此添加鼠李糖脂能够强化烃摄取的主要原因是烃界面的扩大。细胞表面疏水性从开始的急剧升高到后来的不断下降,说明在不同生长阶段细胞对烃的摄取模式是不同的。由此认为,铜绿假单胞菌1.1785既没有通过表面活性剂介导模式获取烃,也并非完全通过直接接     

响应曲面法优化铜绿假单胞菌DN1的产鼠李糖脂条件

鼠李糖脂是近年来具有广阔应用前景的生物表面活性剂之一,因应用范围广和环境友好等特点,使其成为潜在的合成表面活性剂的替代品。本研究以一株能产生鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1为研究对象,采用Plackett-Burman设计和响应曲面方法(RSM)对其产鼠李糖脂的发酵条件进行优化。Plackett-Burman试验设计表明,磷酸盐、C/N比和p H值对鼠李糖脂的产量具有显著影响。在此基础上,采用RSM对3个显著因素的最佳水平范围进行研究,结果表明当磷酸盐为1.71 g/L、C/N比为15.5、p H值为6.5时,其理论最佳鼠李糖脂产量为40.4 g/L,与实测鼠李糖脂产量39.84 g/L非常接近。摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的22.9 g/L提高了73.97%。     

铜绿假单胞菌生防菌株抑菌代谢产物及其生防应用研究进展

微生物次生代谢产物的研究对开发微生物源农药具有重要意义。近年来一系列根际来源的铜绿假单胞菌被分离和鉴定,因其产生抑菌次生代谢产物,具有很好的生物防治效果。本文将系统综述铜绿假单胞菌生防菌株的种类及其抑菌代谢产物的多样性,并进一步介绍铜绿假单胞菌生防菌株的抑菌代谢产物合成机制及其遗传改造,简要讨论铜绿假单胞菌生防菌株抑菌代谢产物在生物防治上的应用和前景。     

以甘油为底物鼠李糖脂高产菌株的诱变选育

通过诱变选育,将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)RG-14利用甘油发酵生产鼠李糖脂产量由13.6g/L提高到16.5 g/L。突变株经过5次连续传代培养,菌株仍维持稳定的鼠李糖脂产量,表明该菌株具有较好的遗传稳定性。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析诱变后菌株发酵甘油生产鼠李糖脂的组成,结果显示鼠李糖脂由Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12组成,其中单、双鼠李糖脂的相对丰度分别为54.8%和45.2%。当以工业粗甘油代替精甘油为底物时,该菌株鼠李糖脂产量达到14.2 g/L,表明其具有较好的应用潜力。     

铜绿假单胞菌对长链烷烃的摄取模式

研究了一株铜绿假单胞菌(CGMCC 1.1785)摄取长链烷烃的模式。铜绿假单胞菌1．1785能够以固态的长链烷烃为唯一碳源生长,在培养过程中产生表面活性代谢物。烃与水相的界面面积是细菌生长重要的影响因素,说明传质限制的存在。由于该菌不能够利用鼠李糖脂增溶的烃作为碳源,因此添加鼠李糖脂能够强化烃摄取的主要原因是烃界面的扩大。细胞表面疏水性从开始的急剧升高到后来的不断下降,说明在不同生长阶段细胞对烃的摄取模式是不同的。由此认为,铜绿假单胞菌1.1785既没有通过表面活性剂介导模式获取烃,也并非完全通过直接接触模式获取烃。据此提出该菌采用了一种运动接触的烃摄取模式,其趋化运动能力在这种摄取过程中起到重要作用。     

铜绿假单胞菌XJ601产鼠李糖脂的优化培养及其稳定性

以1株从原油污染样品中分离获得的铜绿假单胞菌XJ601为研究对象,采用蒽酮比色法定量分析鼠李糖脂,优化其产鼠李糖脂的培养基组成。研究表明:疏水性底物优于亲水性底物,具有更高的鼠李糖脂产量,尤以菜籽油最佳;氮源中,硝酸盐、NH_4Cl能促进鼠李糖脂的合成,以菜籽油为碳源时,最佳氮源为NaNO_3;C/N比值在20时,鼠李糖脂产量最高;P元素的微量添加会影响鼠李糖脂的合成。摇瓶培养获得的鼠李糖脂对不同温度、pH及NaCl浓度都具有较好的稳定性,表明其在三次采油及原油污染生物治理等领域具有较好的应用前景。     

鼠李糖脂粗提物对植物病原真菌的抑菌作用

生物表面活性剂对植物真菌病害的防控效应受到广泛关注.鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌合成的一种阴离子生物表面活性剂,作为植物病原真菌抑制剂的开发潜力较大,但目前对其抑菌谱和抑菌能力还缺乏全面的评价.本研究收集了 29种常见的植物病原真菌,依据真菌Ainsworth系统分类法评价不同分类地位的病原真菌对鼠李糖脂抑制作用的敏感性....     

rsmA调控基因的筛选及其相关表型测定

为了筛选对rsm A具有调控功能的相关基因及这些基因对铜绿假单胞菌致病性的影响,通过构建染色体组上整合有rsm A-lux CDABE报道子的铜绿假单胞菌菌株,并以rsm A基因表达为线索进行随机转座突变,利用发光变化筛选出对rsm A基因表达有影响的转座突变体.最终共得到约30000个克隆,经筛选得到20株发光明显变化的突变体,其中rsm A表达增强的有6个克隆,而rsm A表达减弱的有14个克隆.通过随机PCR并对产物测序及比对,最终确定7个被破坏的基因.对致病性相关表型测定,结果表明细菌运动性、绿脓菌素、鼠李糖脂和胞外多糖产量等均受到不同程度的调节.这些基因对rsm A表达有调节作用,并可能通过rsm A影响铜绿假单胞菌的多个致病因子及致病性.     

Construction of recombinant strain containing vitreoscilla hemoglobin gene(Vnb) of aeruginosa and its rhamnolipid expressing conditions

将RDR(ribonucleotide diphosphate reductase)启动子驱动下的透明颤菌(Vitreoscilla sp.)血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)基因的表达载体pSETRDR-VHb转入铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa)S301菌株中.并对其中阳性转化子AY26菌株进行了鼠李糖脂表达条件的研究.正交实验L9(43)优化培养基,最佳组分为:硫酸镁0.075％、硝酸钠0.5％、清油3mL/L、酒石酸钠0.4％.在限碳培养条件下,转化子SY26鼠李糖脂产量达到12.9 g/L,比对照菌株S301(8.4 g/L)提高150％,5L发酵罐放大实验验证,重组菌AY26的表面活性剂产量达到33.12 g/L.     

超广谱β内酰胺酶肠杆菌拮抗菌的鉴定及抑菌产物分析

本研究对从土壤中筛选出的超广谱β内酰胺酶肠杆菌的拮抗菌进行鉴定,并对其发酵产物抑菌效果进行研究。以分离到的污水中的15株产超广谱β内酰胺酶肠杆菌为测试菌株,土壤中分离到的1株拮抗菌为试验菌株,通过点接种法、平板对峙法和发酵产物抑菌试验测试试验菌株对测试菌住的拮抗作用;通过16S r DNA PCR产物测序及生理生化反应鉴定试验菌株种属;通过发酵产物氯仿粗提物薄层色谱分析试验,结合细菌次级代谢产物基因簇预测在线分析,初步研究试验菌株的抑菌成分。显示试验菌株鉴定为铜绿假单胞菌,对15株产超广谱β内酰胺酶肠杆菌均有拮抗作用,其发酵产物氯仿粗提物中组分之一具有明显抑菌作用,次级代谢产物基因簇在线软件分析推测该产物可能为Nrps、Bacteriocin、Phenazine、Siderophore、Hserlactone、Arylpolyene中的一种或几种。本研究提示铜绿假单胞菌含有多种已知或未知次级代谢产物,为开发利用铜绿假单胞菌资源提供研究资料。     

铜绿假单胞菌生物膜和浮游菌的毒力表达差异

目的探究铜绿假单胞菌生物膜和浮游菌状态下毒力因子的表达差异。方法使用铜绿假单胞菌标准菌株PAO1,分别在生物膜(静置)和浮游菌(摇床)状态下培养,收集上清液,检测总蛋白酶、LasA和LasB弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素、溶血活性;通过荧光定量PCR检测群体感应(quorum sensing, QS)系统相关基因的表达;同时,通过活菌计数检测PAO1在生物膜和浮游菌状态下的生长曲线。结果生物膜状态下,铜绿假单胞菌PAO1的总蛋白酶、LasA、LasB弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素表达均增高(均P0.05),溶血活性增高(P0.05),生物膜和浮游菌状态下细菌生长曲线差异无统计学意义,QS相关基因rhlI、rhlR、rhlA、lasI、lasR、pqsA、pqsR表达增高(均P0.05)。结论铜绿假单胞菌PAO1在生物膜状态下毒力因子表达较浮游菌状态下增高。     

一株铜绿假单胞菌及其产生的鼠李糖脂特性研究

研究高效代谢表面活性剂的菌种,并对菌种和表面活性剂的理化性质进行分析。采用菌种16S rDNA序列分析对菌种进行鉴定,采用紫外光谱扫描、色谱柱层析、薄层层析、单糖分析对生物表面活性剂的种类进行鉴定,并对表面活性剂的理化性质进行研究。从油田采出水中筛选出一株高效代谢生物表面活性剂的菌株T-1,经16S rDNA鉴定为铜绿假单胞菌属(Pseudomonas aeruginosa)。该菌种以甘油和大豆油为碳源的培养基培养4 d后,其发酵液表面张力30.216 mN/m,EI24为100%。根据表面活性剂的红外光谱分析并结合薄层分析,可确定T-1样品中含有糖脂类物质,进一步的表面活性剂的单糖分析显示水解终产物为单一的鼠李糖,最终确定其产物为鼠李糖脂,苯酚-硫酸法测定其鼠李糖脂产率为5.2 g/L,从发酵液提取的棕黄色生物表面活性剂粗品,其表观临界胶束浓度为45 mg/L,该鼠李糖脂对环境(耐温、耐酸碱、耐盐)具有较强的适应性。该表面活性剂对恶劣环境具有较强的耐受性,可应用于微生物采油等用途。     

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响

为研究发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响,从鼠李糖脂的结构组分、性能和应用效果等方面展开研究。薄层实验证明两种鼠李糖脂均含有单糖脂和双糖脂。液质分析发现以橄榄油作碳源时,鼠李糖脂中双糖脂(Rha-Rha-C5-C6:1和Rha-Rha-C8-C8:2)比例更大,约为73.09%。而地沟油作碳源时,单糖脂(Rha-C10-C10和Rha-C16-C16:2)的比例更高,约为76.91%。橄榄油和地沟油为碳源的鼠李糖脂的临界胶束浓度(CMC)分别为55 mg/L和80mg/L。相同投加量时,前者乳化性和乳化稳定性均优于后者。NY3菌降解含油污泥时,投加双糖脂含量高的鼠李糖脂会使C16-C30直链烷烃的去除率更高。     

一株表面活性剂产生菌的筛选及其特性研究

从氧化沟含油污水中分离得到1株能产生物表面活性剂菌株S6(Pseudomonas sp.),经生理生化实验和16SrDNA序列分析鉴定,S6为铜绿假单胞菌。红外光谱分析得知S6在代谢过程中能够产生糖脂类表面活性物质。其临界胶束浓度(CMC)为50mg/L,可将水的表面张力由72mN/m降到33.9mN/m。发酵液的表面张力和排油直径的测定结果显示发酵液在不同的盐度、pH和溶解氧量条件下,具有较稳定的表面活性。通过正交实验确定了优化培养基条件为葡萄糖10g、尿素5g、磷酸二氢钾1g、微量元素液2mL、pH8.0、水1000mL;S6在优化培养基中合成生物表面活性剂的产量为0.173g/L。     

产鼠李糖脂菌株种子培养条件和C、N源的优化

对自行筛选的3个可利用废弃油脂进行发酵生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌菌株进行评价,并进行了种子培养条件和摇瓶发酵部分条件的优化。种子培养优化实验表明,当培养基pH 6～8,培养温度为30 ℃时最利于菌体生长。菌株均具有一定的耐盐性,在5%的盐度下生长未受到明显抑制,因此在沿海地区采用盐水或海水发酵具有较广阔的应用前景。通过排油圈、表面张力、苯酚-H2SO4比色法比较了这3个菌株的表面活性剂表面活性的大小,以表现较好的Z41进行了摇瓶发酵条件的优化。单因素实验表明,发酵较优条件为发酵温度30 ℃,接种量5%。在此基础上,通过正交试验对Z41菌株发酵培养基中的C、N源进行了研究,实验结果表明,在考虑因素间交互作用和发酵成本的情况下,最佳C源为3%炸货油,最佳N源为3.5 g/L尿素。在此发酵条件下,糖脂产量较高13.024 g/L,且成本较低。