猪圆环病毒2型Cap蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的多克隆抗体。以PCV2毒株(CAU0673)DNA为模板进行PCR,扩增目的片段大小约为702 bp,构建pET30a-PCV2-Cap重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对目的蛋白进行NiNTA树脂亲和层析纯化、复性,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;将纯化后的重组Cap蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,经背部皮下多点注射4次,免疫新西兰大耳白兔,制备成兔抗Cap蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)验证兔抗血清特异性,并用间接ELISA测定抗血清抗体效价。PCR、双酶切和测序鉴定结果表明,重组质粒pET30a-PCV2-Cap构建正确;重组Cap蛋白以包涵体的形式表达,大小约为34 kD,复性后重组Cap蛋白可与PCV2阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体与PCV2重组Cap蛋白和全病毒抗原均可发生反应,ELISA抗体效价 1∶12 800,显著高于商品化疫苗组。     

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。     

猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白免疫原性的鉴定和应用及其多抗在PCV2感染诊断中的应用

猪圆环病毒2型ORF2编码与病毒毒力相关的结构蛋白--核衣壳蛋白(Cap),该蛋白可以用于PCV2感染的血清学调查,但不同区域的PCV2分离株的ORF2特别是其抗原表位序列存在一定的突变.本研究将PCV2浙江分离株ORF2的主要抗原表位以及PCV1 ORF2进行了原核表达,将分别纯化的融合蛋白Cap2s和Cap1s免疫SPF兔后制备多抗,并进一步分析了纯化蛋白的免疫原性和多抗的特性.Western blot结果表明无论Cap2s和Cap1s均能与两个多抗发生交叉反应,而PCV2或PCV1阳性猪血清只能分别特异性地识别Cap2s和Cap1s.IFA结果则证明两个多抗对于天然Cap蛋白无交叉反应性.利用Cap2s作为包被抗原对13个猪场的259份血清样品的PCV2抗体进行ELISA检测,平均阳性率为80.69%(209/259),而各猪场的阳性率差异较大(48.28%～100%).以上结果表明Cap2s可作为一个型特异性抗原用于浙江省本地猪场猪群血清中PCV2抗体的监控,而其多抗也可用于免疫组化对PCV2感染进行有效诊断.     

猪圆环病毒2型（PCV2）核衣壳蛋白免疫原性的鉴定和应用及其多抗在PCV2感染诊断中的应用

猪圆环病毒2型ORF2编码与病毒毒力相关的结构蛋白--核衣壳蛋白(Cap),该蛋白可以用于PCV2感染的血清学调查,但不同区域的PCV2分离株的ORF2特别是其抗原表位序列存在一定的突变.本研究将PCV2浙江分离株ORF2的主要抗原表位以及PCV1 ORF2进行了原核表达,将分别纯化的融合蛋白Cap2s和Cap1s免疫SPF兔后制备多抗,并进一步分析了纯化蛋白的免疫原性和多抗的特性.Western blot结果表明无论Cap2s和Cap1s均能与两个多抗发生交叉反应,而PCV2或PCV1阳性猪血清只能分别特异性地识别Cap2s和Cap1s.IFA结果则证明两个多抗对于天然Cap蛋白无交叉反应性.利用Cap2s作为包被抗原对13个猪场的259份血清样品的PCV2抗体进行ELISA检测,平均阳性率为80.69%(209/259),而各猪场的阳性率差异较大(48.28%～100%).以上结果表明Cap2s可作为一个型特异性抗原用于浙江省本地猪场猪群血清中PCV2抗体的监控,而其多抗也可用于免疫组化对PCV2感染进行有效诊断.     

表达猪圆环病毒2型Cap和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合蛋白重组腺病毒的构建和免疫原性测定

断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)是目前规模化猪场常见的传染病,由PCV2感染引起。临床上PCV2与PRRSV混合感染较常见,死亡率和发病率很高,但目前尚无能有效预防该病的商品化疫苗。本研究利用基因克隆方法,构建融合表达PCV2-Cap蛋白与PRRSV-GP5蛋白的重组腺病毒rAd-Cap-GP5,经IPMA、IFA和Western blotting验证了Cap蛋白和GP5蛋白在该重组病毒中获得表达。将该重组腺病毒免疫小鼠测定其抗体、中和抗体,结果显示小鼠免疫后出现两种病毒的抗体和中和抗体,诱导小鼠产生明显的体液免疫应答,可以作为预防PCV2-PRRSV混合感染的基因工程疫苗候选毒株,为PCV2和PRRSV二联重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种毁灭性传染病,给养猪业造成重大经济损失。猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)是一株非常安全、有效的优秀弱毒疫苗,对各年龄和品种的猪都极其安全,同时对不同基因亚型的CSFV均能提供有效的免疫保护。在现地,CSFV和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的现象时常发生,有必要研制针对这两种病毒混合感染的二价疫苗。本研究首次构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组C株,并评价了其在体内外的特性。结果表明,该重组病毒与C株具有相近的体外增殖特征,能够稳定表达Cap蛋白,在家兔体内具有与C株相似的生物学表型,在免疫家兔后10 d,抗CSFV E2抗体全部转阳,然而抗Cap抗体未能转阳。本研究为进一步优化表达PCV2Cap蛋白的重组C株奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达（英文）

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease, PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。     

OGT 多克隆抗体的制备及特异性分析

目的:为了探讨O-GlcNAc糖基转移酶OGT的生理和病理作用,需制备能高效特异性检测OGT的抗体。方法:在NCBI数据库中,查找人源OGT基因序列,根据OGT的结构特点,选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列(464-949位点氨基酸)做抗原。首先,构建OGT的C末端催化结构域(464-949位点氨基酸)的重组表达载体pET30-a-OGT-C,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白,Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白。再以OGT-C重组蛋白作为抗原,免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测OGT抗体的效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果:多抗效价达1:80000;在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测重组抗原,并可以特异性识别培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型。结论:实验结果表明,获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体,在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达。     

抗博尔纳病病毒核蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的利用重组博尔纳病病毒核蛋白进行动物免疫,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。方法将重组载体pET14b-p40转化至感受态大肠埃希菌I,PTG诱导融合蛋白的表达,His-tag亲和层析纯化重组核蛋白并作为抗原免疫新西兰大白兔,收集免疫后血清,制备和纯化多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,并进行Western-blot鉴定。结果成功制备出核蛋白多克隆抗体,ELISA检测效价高达1︰256000;该抗体与原核和真核系统中表达的核蛋白均能发生特异性反应。结论成功制备了效价和特异性良好的抗重组核蛋白多克隆抗体,为博尔纳病病毒血清免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2与猪GM-CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析

旨在构建含融合基因pGMCSF-ORF2的重组腺病毒,并对其表达水平和免疫效果进行分析.运用PCR方法扩增PCV2 ORF2和pGM-CSF基因,拼接后克隆入pMD18-T载体,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后电转化含腺病毒基因组(AdEasy-1)的大肠杆菌细胞BJ5183-Ad-1,成功获得了重组腺病毒DNA.将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD293细胞,经过病毒基因组的PCR和转录水平的RT-PCR及Western blot等方面对融合蛋白的表达进行了鉴定.以该病毒免疫Babl/c小白鼠,对免疫小鼠血清中PCV2抗体进行检测.结果显示,获得了pGMCSF-ORF2重组基因,重组腺病毒载体构建成功,获得了表达pGMCSF-ORF2融合蛋白的重组腺病毒.该病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中检测到了PCV2的特异性抗体.获得的重组腺病毒能有效表达pGMCSF-ORF2融合蛋白,且可诱导小鼠产生针对PCV2的特异性抗体.     

炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达及其多克隆抗体的制备

原核表达炭疽杆菌保护性抗原受体结合区并制备该蛋白的多克隆抗体.从炭疽芽胞杆菌A16R中经PCR扩增得到了炭疽菌保护性抗原(PA)受体结合区基因,即PA的第四结构域(PA-D4),将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-2b(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrapTM Chelating HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western blot检测抗血清.结果表明,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对PA-D4融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1∶ 102 400;其抗体能特异性识别内源性的PA.PA-D4重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能和炭疽疫苗免疫保护机制奠定了基础.     

Angioarrestin(hARP1)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定

Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestinC端hFDcDNA和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经0.3mmol/LIPTG在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET-22b( )表达系统获得的hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明:通过基因重组可获得angioarrestinC端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验

构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。     

人免疫缺陷病毒早期蛋白Nef的表达、纯化及免疫原性研究

目的：通过原核细胞表达人免疫缺陷病毒（HIV）Nef抗原,制备特异抗血清,为Nef抗原检测提供技术方法。方法：以HIVBotswana毒株基因组为模板,用PCR法获得Nef蛋白编码基因,将其克隆到pET30a载体中,在大肠杆菌中表达Nef融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清,用真核表达的Nef抗原对其特异性进行分析。结果：构建的Nef融合基因在大肠杆菌中获得表达,相对分子质量约为36x103,免疫BALB／c小鼠获得针对融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1：6400;免疫荧光和Westemblot检测表明,该抗血清能特异地与重组痘苗病毒表达的Nef抗原反应。结论：在大肠杆菌中表达了HIVNef融合蛋白,制备了Nef融合蛋白的高效价小鼠免疫血清,该血清能特异性识别HIVNef抗原,为HlVNef抗原检测提供了技术方法。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因.本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013 7/mL.用RT-PCR、间接ELISA、Western blot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达.该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及在小鼠体内免疫特性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因是该病毒基因工程疫苗的重要目的基因,但其在大肠杆菌表达系统中的表达产物通常以包涵体形式存在,影响其作为亚单位疫苗使用的免疫保护作用。将ORF2基因密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子,或构建MPG与ORF2基因融合,分别克隆至表达载体pET28a,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot结果证实改造后的PCV2 Cap蛋白基因实现了可溶性表达。将上述两种重组蛋白纯化后,分别与GEL01、ISA206或ISA15A三种佐剂混合配制疫苗,小鼠免疫保护试验结果证明,以GEL01为佐剂的两免疫组PCV2 ELISA抗体和中和抗体水平最高。攻毒试验结果显示,除ISA15A组外,其他各免疫组脾脏中 PCV2 含量都显著低于非免疫对照组,表明两种重组蛋白与佐剂GEL01和ISA206制成的疫苗可诱导产生一定水平的免疫保护作用,为PCV2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

多胺调节因子-1原核表达与多克隆抗体制备

[目的]原核表达和纯化人多胺调节因子-1(PMF-1)并以此为抗原制备多克隆抗体。[方法]PCR扩增人PMF-1编码序列并构建原核表达质粒。将此质粒转化大肠杆菌后,IPTG诱导PMF-1蛋白表达并在变性条件下用NiNTA树脂纯化。将纯化的PMF-1用作抗原免疫大耳白兔以制备抗PMF-1多克隆抗体。ELISA法检测抗体效价,免疫印迹法和细胞免疫化学法分析抗体特异性。[结果]成功构建PMF-1原核表达质粒,在大肠杆菌中IPTG可诱导该质粒高效表达PMF-1蛋白。以纯化的PMF-1蛋白为抗原免疫大耳白兔后,获得高效价的抗PMF-1抗血清(抗体效价为1∶128 000)。该抗体能与PMF-1蛋白特异性结合,并可用于PMF-1的免疫印迹和细胞免疫化学分析。[结论]成功建立了人PMF-1原核表达和纯化技术,并制备出高特异性的抗PMF-1多克隆抗体,该抗体可用于PMF-1的免疫印迹分析和细胞免疫化学分析。