重组标签蛋白在蛋白质纯化中的研究进展

重组蛋白的表达纯化是研究蛋白质结构与功能的重要环节之一,表达重组蛋白宿主细胞的监测筛选和重组蛋白低水平可溶性表达、低回收率以及不稳定易水解等问题一直是蛋白质高通量纯化工艺中的难题。近年来,将多肽或蛋白质作为标签,与目标蛋白共表达的方法已经很大程度地解决了这一问题。因此,针对不同特性的蛋白质选择合适的标签纯化策略在重组蛋白纯化研究中是相当关键的环节。本文回顾了几种传统标签蛋白的研究概况(His-tag,Arg-tag,Flag-tag,GST-tag,MBP-tag等),着重对近年来新开发的了几种标签蛋白(Si-tag,Halo-tag,Intein-CBD-tag,ELPs-tag等)进行了深入探讨,并对新标签蛋白在蛋白质纯化中的应用前景作以展望。     

快速筛选高效表达重组蛋白毕赤酵母菌株新方法的建立及评价

毕赤酵母是当前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,文中建立了一种快速筛选高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株的新方法。首先,对内质网转膜蛋白Sec63融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的改造菌株GS115-E表达重组蛋白的能力进行检测;之后将携带不同拷贝数的植酸酶phy基因或木聚糖酶xyn基因的质粒转化进入GS115-E中,得到具有不同植酸酶或木聚糖酶表达水平的重组菌株,分别检测不同菌株的EGFP与重组蛋白的表达水平;最后,利用分选型流式细胞仪,根据绿色荧光值的高低对包含不同植酸酶表达水平的重组菌株的菌群进行分选。结果显示重组菌株中EGFP的荧光值与重组蛋白的活性表达水平之间具有良好的线性相关性(0.8|R|1),且利用流式细胞仪可高效地从混合菌群中筛选得到高产菌株,所分选得到的高荧光菌株在摇瓶发酵120 h时植酸酶表达水平是低荧光菌株的4.09倍。本方法通过检测菌株的EGFP荧光值代替检测重组蛋白的表达水平和活性,从而实现高表达菌株的筛选,大大提高了其应用的便捷性及通用性。与流式细胞仪、液滴微流控等高通量筛选仪器或技术结合将进一步提高筛选的速度与通量,为筛选获得高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株提供了简便、快速的新途径。     

人钙周期蛋白结合蛋白（hCacyBP）基因的克隆与表达

筛选cDNA文库得到了人的钙周期蛋白结合蛋白基因 ,将此基因的全编码区克隆到原核表达载体pET2 8上 ,诱导目的蛋白质表达以后将重组蛋白质用亲和层析的方法进行纯化 ,得到了纯度很好的重组的目的蛋白质 ,以此作为抗原免疫动物 ,得到抗钙周期蛋白结合蛋白的特异多克隆抗体。Western印迹的结果表明 ,该基因在小鼠多种组织中广泛表达 ;免疫组化的结果表明 ,BT32 5细胞诱导分化后钙周期蛋白结合蛋白分布有变化 ,由分布于胞质中转向分布于胞核和核周胞质     

利用EDA融合标签高效表达猪圆环病毒2型壳蛋白

原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用。然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表达量低等问题。因此,通过使用各种融合标签以增加目的重组蛋白的表达量和溶解性成为有效的方法。本研究通过使用3种融合标签（EDA标签、MBP标签和GST标签）以获得表达量高的可溶性重组表达猪圆环病毒2型壳蛋白;并比较3种融合标签对该蛋白表达量、溶解性和稳定性的影响。研究结果表明,EDA标签可以显著提高重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,并且能够增强该蛋白的稳定性;MBP标签可增强重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,但是不能改善该蛋白的稳定性;GST标签能够增强该重组表达蛋白的表达量,但是不能增强该蛋白的溶解性和稳定性。本研究将EDA作为PCV2-CP蛋白的融合标签,显著提高PCV2-CP-EDA重组蛋白的表达量和增强该重组蛋白的稳定性,为病毒蛋白的可溶性重组表达提供了一种新的融合标签。     

硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达

以人工设计的,不含半胱氨氨酸残基的三元蛋白,六聚和八聚鲑鱼降钙素融合蛋白和人尿激酶原等不同半胱氨酸残基含量的外源蛋白质为例,利用大肠杆菌硫氧还蛋白还原酶基因缺陷菌GH980（DE3 trxB^-）,探索把以包涵体形式表达的外源蛋白质变为可溶性表达的可能性及其规律。研究表明：由于硫氧还蛋白还原酶基因的缺陷所引超的细胞质氧化还原态势的变化,使一些在普通大肠杆菌宿主中以包涵 形式表达,含有半胱氨酸残基的重组蛋白,在GJ980中能在一定程度上以可溶性蛋白质形式表达;不含有半胱氨酸残基的重组蛋白在GJ980中仍以包涵体形式表达,推测重组蛋白在GJ980细胞质中形成二硫键对其正确构象的形成具有一定的作用。     

一种改良的快速筛选重组DNA噬菌体噬斑的原位杂交技术

报道了一种从表达型噬菌体载体——λgt11构建的基因文库中筛选重组DNA噬菌体噬斑的改良蛋白质-蛋白质原位杂交枝术。此法可使噬菌体在硝酸纤维素薄膜上增殖至原噬斑大小,经适当处理后,即可用特异性抗体探针进行原位筛选,以 获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。与己报道的筛选方法相比,此法具有简便快速、灵敏可靠的特点;也可试用于由表达型质粒载体构建的基因文库之菌落原位筛选。     

FABP5基因重组突变体蛋白抗前列腺癌细胞活性分析

为构建脂肪酸结合蛋白5 (FABP5)突变体的原核表达体系,评价突变体蛋白质体外抗前列腺癌细胞的活性.利用定点突变技术,突变FABP5蛋白脂肪酸结合的3个关键位点,并构建原核表达体系,对重组蛋白质进行原核表达、分离纯化.通过细胞毒性、细胞划痕和细胞侵袭试验,评价重组FABP5突变体蛋白质对前列腺癌细胞22RV1和PC3增殖、迁移和侵袭的影响.结果 显示定点突变后的DNA与表达载体pQE32连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),经序列测定正确,构建了重组表达工程菌,并诱导表达的重组蛋白经亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白;三突变体对细胞的增殖、迁移和侵袭抑制作用比3个单突变体和3个双突变体抑制效果明显;单突变体和双突变体组内对细胞的增殖、迁移和侵袭抑制作用差异较小;而野生型重组蛋白质对两株细胞的增殖、迁移和侵袭具有促进作用.本研究从所有突变体中筛选出FABP5的三突变体重组蛋白质对前列腺癌细胞抑制作用较好,为后续开发去势抵抗性前列腺癌(CRPC)蛋白质药物提供参考.     

高等植物叶绿体表达重组蛋白研究进展

近年来,基因工程技术发展迅速,许多重组蛋白得以表达。其中利用植物生物反应器表达特异药物蛋白为人类一些重要疾病的预防和治疗提供了新途径。植物叶绿体遗传转化和表达系统成为目前植物生物反应器的研究热点。因结构和遗传上的特殊性,高等植物叶绿体在重组蛋白表达方面具有独特优势,外源基因表达量高、定点整合,而且叶绿体母系遗传特性保证了生物安全性。很多重要药用蛋白质在植物叶绿体中表达成功。烟草作为高等植物叶绿体转化模式植物,在疫苗抗原、抗体等药物蛋白和其他重要重组蛋白表达方面取得显著进展。高等植物叶绿体遗传转化也为叶绿体基因的表达和调控机制的研究提供新的技术和方法。文中从叶绿体遗传转化原理、载体构建、重组蛋白和重要药物蛋白在叶绿体中的表达以及重组蛋白表达对植物代谢和性状影响等多个角度,对高等植物叶绿体遗传转化体系研究的新进展进行了综述,以期为叶绿体表达平台的开发和重要药用蛋白质的表达提供新思路。     

衣藻叶绿体表达重组蛋白及表达优化策略

近年来,转基因技术已日趋成熟,医学、工业上的应用也越来越广泛。以重组蛋白为基础的药物治疗是目前医药生产领域发展最快的一项技术。它们的高特异性和低副作用使得治疗效率十分突出。但是重组蛋白表达的复杂性也给生产带来了一定限制。为了促进重组蛋白的应用,人们对适宜其表达的系统和能促进其表达的策略进行了探索。研究发现,衣藻叶绿体作为重组蛋白的生物反应器,能实现重组蛋白快速、高效、低成本生产。同时,衣藻能在人工培养基和人为控制的条件下生长,降低了受污染的风险,与传统的生产系统比较具有不可比拟的优越性。因此,衣藻叶绿体作为医药重组蛋白生物反应器在未来的生物技术领域将发挥巨大作用。     

鸭疫里默氏杆菌RecA作为一种内参蛋白的评价

由于缺少适合的内参蛋白,所以用Western blot的方法来研究鸭疫里默氏杆菌蛋白表达的调节尚未见报道。以鸭疫里默氏杆菌基因组为模板,PCR扩增含有组氨酸标签His-tag的rec A基因和截段的rec AP基因,并分别将其克隆于原核表达载体p ET32a。将重组质粒转化到表达菌Rosetta中,经1mmol/L的IPTG诱导进行蛋白质表达。用组氨酸标签亲和试剂镍-琼脂糖进行重组蛋白质的纯化。用纯化的重组蛋白对4周龄的昆明鼠进行免疫,制备多克隆抗体。Western blot实验表明,截段表达的Rec AP的多克隆抗体血清比全长Rec A蛋白的多克隆抗体血清与鸭疫里默氏杆菌总蛋白反应更特异;在铁离子限制性环境和血红素丰富环境中培养的鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白表达量一致。因此,鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白可以在铁离子和血红素代谢等研究中作为Western blot的内参蛋白。     

用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术

近年来,用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达领域涌现出一系列革命性的新技术。优化的工程细胞为表达重组蛋白提供了优良的宿主;基于荧光的筛选方法可以快捷地得到高表达细胞株;高通量的培养工艺能够预测适合外源蛋白表达的细胞培养条件;可抛弃式生物反应器为大规模细胞培养提供了更多的选择;大规模瞬时表达技术节省了重组蛋白的生产时间。这些新技术提高了重组蛋白的研发和生产效率,加快了蛋白药物的工业化进程。     

基于植物重组蛋白产量提高的研究进展

重组蛋白为疾病治疗提供了新手段,同时创造了可观的经济效益。利用经济作物(主要是烟草)、谷类作物、豆科作物和蔬菜作物生产具有药用价值的重组蛋白是“分子农业”最热门的研究内容。尽管许多重组蛋白已在植物中表达,但只有一小部分已成功投入使用。为了极大地克服限制植物生产重组蛋白发展的问题,研究人员改进表达系统以增加重组蛋白的产量。本文从分析植物产生重组蛋白产量低和/或生物活性低等问题入手,综述了近些年来解决这些问题的优化策略,同时提出了提高植物生产重组蛋白产量的研究方向。     

表达猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

目的:构建并筛选表达猴免疫缺陷病毒(SIV)Env蛋白的重组鸡痘病毒(FPV),并对其进行鉴定。方法:设计引物,通过PCR技术扩增SIV env基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的FPV穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-SIV env,然后将其与FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR、RT-PCR、Western印迹对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组FPV基因组中,RT-PCR、Western印迹结果表明SIV Env蛋白在感染细胞内表达且具有抗原性;连续传代20次,PCR、RT-PCR、Western印迹均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,且病毒已经纯化。结论:获得表达SIV Env蛋白的重组FPV,为进一步免疫试验研究奠定了基础。     

拟南芥LFR原核重组蛋白纯化和多克隆抗体制备

拟南芥中有一类含ARM结构域的蛋白质,研究表明它们中的一些在植物的生长发育和激素应答等方面发挥着重要的作用.在拟南芥突变体筛选中,获得了一个推测编码蛋白含ARM重复序列的新基因突变体lfr(leaf and flower related mumnt),它在叶子和花的发育过程中表现出较明显的表型.为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,构建了pGEX-2TGST:LFR融合蛋白重组表达载体,将重组质粒转化到工程菌中诱导表达菌体蛋白,经SDS.聚内烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明,融合重组蛋白成功获得了高效表达,分子质量在77 ku左右.重组蛋白经谷胱甘肽S.转移酶(GST)标签蛋白亲和层析法纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到纯度较高的抗原.经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清.采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化,结果得到只识别LFR重组蛋白的抗血清.进一步提取拟南芥野生型及突变体的核蛋白,经蛋白质印迹检测,结果显示,在分子质量50ku左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗血清可以与拟南芥LFR蛋白特异性结合.     

GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质北大核心CSCD

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

重组SARS冠状病毒M蛋白的表达、纯化及鉴定

SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。根据对其他种类冠状病毒的研究结果 ,膜蛋白 (M蛋白 )是病毒主要的结构蛋白 ,重组M蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗。SARS病毒M蛋白基因克隆到原核表达载体pMAL cRI中 ,利用N端和C端分别融合麦芽糖结合蛋白 (maltosebindingprotein和MxeGyrAinteinCBD的策略 ,在大肠杆菌中初步表达了重组M蛋白 ,并通过Western印迹和质谱对蛋白质进行了鉴定。重组蛋白质经亲和层析得到了部分纯化 ,纯化后的蛋白质将用于功能研究与诊断试剂盒的研制。     

幽门螺杆菌毒素蛋白CagA诱导的蛋白的差异表达分析及其基因在胃癌组织中的表达

为了研究胃癌细胞中幽门螺杆菌(Hp)毒素蛋白CagA诱导的蛋白差异表达及其基因在人胃癌组织中的表达,用Hp感染胃癌细胞系SGC 7901和AGS及用含CagA基因的表达载体稳定转染SGC 7901细胞, 构建3组实验模型.提取各组细胞的总蛋白进行双向凝胶电泳,筛选3组重叠的差异表达蛋白质斑点进行质谱鉴定.共获得135个差异表达的蛋白质,其中上调蛋白质73个,下调蛋白质62个. 鉴定出10个差异表达蛋白质, 其中有6个差异表达蛋白是首次发现,它们主要参与细胞的能量代谢和信号转导等.最后定量检测了这10个差异表达蛋白基因在人胃癌组织中的表达, 发现有4个基因高表达和1个基因低表达. 本结果将为研究幽门螺杆菌感染引起胃癌的分子机制提供新的线索.     

杆状病毒表达载体系统

杆状病毒表达载体系统是近年来发展起来的较高效的表达外源基因系统。由于多角体病毒中多角体蛋白基因的非必需性、高表达性、重组病毒的易鉴定等特性,以及多角体蛋白基因的强启动子使其特别适于基因工程中作为表达载体,借助于转移载体可将外源目的基因转移到野生型AcMNPV中,在一个被转移载体和野生型AcMNPV共转染的细胞内,可以通过同源重组完成目的基因的转移。应用不同的转移载体可表达出融合及非融合蛋白质。经该系统表达的重组蛋白质具有生物学活性,其中大部分进行翻译后剪接产生与天然蛋白质相似的重组蛋白质。这些产物的抗原性,免疫原性和功能都与天然蛋白质非常相似。目前,应用该系统已成功地表达了许多酶、生长因子、病毒抗原包括病毒的外壳蛋白等有生物活性的蛋白质。本文对如何最大限度表达外源基因及该表达系统的发展前景作了讨论。     

GST pull-down联合质谱筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质

（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1（dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1）是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome related organelles complex 1, BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽 琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱（LC MS/MS）分析筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用BioGPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO（gene ontology）富集分析。本实验共筛选出108个（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。