异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β—半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动了控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的,有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

含有昆虫杆状病毒多角体蛋白基因的转运质粒的构建

为了利用苜蓿尺蠖核多角体病毒作为表达外源基因的运载体,我们将含有该病毒多角体蛋白基因的EcoR I I片段克隆在大肠杆菌质粒pBR325中。并对这一片段进行改建,构建成两个可以将外源基因置于多角体蛋白基因启动子控制下的表达质粒。     

增强蛋白与多角体蛋白共包埋的研究

颗粒体病毒的增强蛋白（enhancin)是一种能显著提高核型多角体病毒（NPV）对昆虫感染力的病毒蛋白。构建了一种不形成多角体但表达粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白的重组病毒AcBBH-TnEn,将它与野生型AcMNPV共同感染SF21细胞,经SDS－PAGE、免疫印迹分析、荧光免疫等方法检测证实,增强蛋白与多角体可在同一细胞中同时表达,而且发现所形成的病毒多角体带有增强蛋白。这表明,可以通过混合感染的方式生产带有增强蛋白的病毒多角体。     

肌动蛋白抑制了杆状病毒多角体蛋白基因的转录与表达

为进一步研究肌动蛋白在杆状病毒感染晚期的作用,利用Bac-to-Bac系统构建了表达多角体基因、肌动蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的重组病毒vAc-ph/70GA,同时构建对照病毒vAc-ph.实验发现,重组病毒vAc-ph/70GA感染Sf9细胞后能持续表达肌动蛋白,但不能形成多角体,vAc-ph则能形成多角体.sDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,vAc-ph/70GA感染晚期,细胞内没有多角体蛋白的表达;RT-PCR的结果进一步表明多角体基因的转录被抑制.肌动蛋白的表达并没有影响vAc-ph/70GA对细胞的感染力.结果表明,晚期表达的外源肌动蛋白抑制了多角体基因的转录和表达,从而导致多角体不能正常产生.     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体,在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的,该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ-１的多角体蛋白基因启动子下游,构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞,通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选,获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定,证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒,提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和免疫印迹分析,结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。     

一种新颖的棉铃虫单闰包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini-F replicon,一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid-HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFast BacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上。随后将含有eGFP基因的重组HZAml细胞内。转染5d后,细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的HaBac to Bcac表达系统能有效的表达外源基因。     

柞蚕核型多角体病毒多角体蛋白基因上游5'端核苷酸序列分析

核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus,简称NPV)的核多角体蛋白(Polyhedrin)基因具有一个非常强的启动子和基因调控序列。目前利用这一基因的上述序列已组建了多种表达载体,高效地表达了十几种外源基因产物,成为当前最有前途的新的表达系统。但是,在组建这一病毒载体过程中,为了使插入的外源基因靠近病毒启动子序列,各     

以核多角体病毒为载体在家蚕中生产外源蛋白

以家蚕核多角体病毒(BmNPV)为载体,在家蚕幼虫或家蚕培养细胞系中表达的外源基因越来越多,其表达的产物已涉及到医用药物、医疗诊断、疫苗生产、生物防治等诸多领域,文章就BmNPV的特性及其基因组构造,多角体蛋白基因的特性,重组BmNPV的构建及其在家蚕幼虫体内和细胞系中的表达,BmNPV-家蚕表达系统的外源蛋白生产效率及其应用等各个方面作了全面、系统的综述.     

柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)转移载体质粒pAp M2614的组建

自从美国科学家G.Smith等首次建立苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)转移载体表达系统以来,已被广泛用于外源基因的表达,成为世界上一新的具有巨大潜力的载体表达系统。为了进一步提高表达产量,降低成本,日本科学家前田进建立了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体表达系统,并获得了高效表达。柞蚕是我国特产,以蛹滞育越冬,保存时间长,个体大,可工厂化生产。因此,组建柞蚕NPV转移载体,进而建立该载体表达系统,是目前利用昆虫活体为宿主进行外源基因表达较理想的昆虫杆状病毒载体表达系统。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus.BmNPV)和家蚕细胞已成功地用来大量生产具有生物活性的重组蛋白。但是BmNPV的通用载体的类型较少。因此,本实验构建了BmNPV新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的 12位外连接有5个外源基因的克隆位点。将HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的 12位后,构建了pBmIFN 12;同时构建HuIFN-β克隆在-3位后的转移栽体pBmIFN-3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm-N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN-β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN 12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性最高时可达2.0×10~6IU/ml,将BmIFN 12注射5龄家蚕虫体,表达水平为50×10~7IU/ml,是HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒的表达量的2～4倍。家蚕体生产的rHulFN-β为糖基化蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

本期重点推介

将特定的金属元素结合到蛋白质上,在生物学研究中有助于蛋白质定位等,而在技术应用中有助于开发功能性生物-无机纳米复合器件。北京化工大学生命科学与技术学院宋磊和陈劲春基于已报道的杆状病毒表面展示技术,利用Bac-to-Bac表达系统,将金特异性结合短肽基因Au-bp同家蚕核型多角体病毒BmNPV的gp64基因进行连接,重组到AcMNPV中,构建成多角体启动子控制下表达融合     

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体的制备

为了建立一种基于免疫反应检测茶尺蠖核型多角体病毒的方法,以纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经间接ELISA筛选及克隆得到了一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为7D3。同时克隆并在大肠杆菌中表达了EoNPV多角体蛋白基因,获得重组多角体蛋白。经Western blotting鉴定,该抗体可与EoNPV的多角体蛋白特异性结合。利用制备EoNPV多角体蛋白的单克隆抗体,建立了间接ELISA测定EoNPV的方法。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)DNA的提纯及多角体蛋白基因片段的克隆

本文报道了从被AcNPV感染的大蜡螟中提纯到AcNPV DNA,以质粒pBR325作为载体,从AcNPV基因组DNA EeoRI片段克隆中得到含AcNPV多角体蛋白基因片段的重组质粒。经原位杂交,酶切鉴定,DNA顺序分析,并与Hooft Van Iddekinge等人测定的结果比较,证明筛选到的7.3kb EcoRI片段包含了AcNPV多角体蛋白结构基因及其启动基因。核多角体病毒多角体蛋白启动基因是迄今为止在真核细胞中所发现的最强启动基因之一,是理想的表达外源基因的启动子。     

家蚕BmNPV多角体蛋白与外源蛋白共包埋入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒多角体的包装特性,构建了一种不形成多角体但能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒vBmBac(polh-)-5B-EGFP,将其与野生型BmNPV共同感染BmN细胞,于荧光显微镜下观察到EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。上述结果表明,多角体可以将自身病毒粒子以外的其他病毒粒子的成分包装进入多角体,表明多角体的包装机制中存在非特异性识别机制。     

转座子介导的多角体基因表达及提高病毒粒子的感染效率

现行的杆状病毒表达外源基因的方法是将外源基因取代病毒中的多角体基因,因而得到的重组杆状病毒感染活体时不能经口感染,只能进行针刺注射,效率低且易引起活体感染其他疾病。将家蚕核型多角体病毒(Bombyx mor inucleopolyhedrovirus,BmNPV)中的多角体基因(polyhedrin,poly)及其启动子片段克隆到转座子载体pigA3GFP中,将其与辅助质粒pHA3PIG利用脂质体介导法导入家蚕细胞中,经过多次筛选获得稳定的转基因家蚕细胞。之后先将BmPAK6(含LacZ)及BmGFP(含GFP)重组病毒分别感染转基因细胞,再将得到的重组病毒经口感染5龄家蚕幼虫。结果显示,重组杆状病毒可以经口感染家蚕幼虫。这些研究表明来自于转基因家蚕细胞的poly基因表达产物可以提高重组杆状病毒经口感染家蚕率,为解决杆状病毒表达系统中重组病毒不能经口感染家蚕幼虫的问题提供新思路。     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBACHTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBACS10,重组穿梭质粒BacmidS10,重组杆状病毒AcS10。多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测。结果表明:S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核。     

BmNPV蛋白激酶基因核苷酸序列,转录和缺失分析

家蚕核型多角体病毒ＺＪ８株蛋白激酶（ＢｍｖＰＫ－１）基因编码区全长８２８个核苷酸,可编码２７６ａａ的多肽,推测分子量为３２ｋＤ。ＲＮＡ杂交显示病毒感染细胞后１８ｈ,该基因已开始转录,感染后４８ｈ达高峰,为一种晚期或极晚期基因。删除该基因编码区中最保守的３６５ｂｐ,在缺失部位插入ｌａｃＺ基因构建转移载体。与野生型病毒ＤＮＡ共转染ＢｍＮ细胞。同源重组后检测到表达ｌａｃＺ基因的重组病毒蓝斑。但空斑纯化方     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBAC HTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBAC S10,重组穿梭质粒Bacmid S10,重组杆状病毒Ac S10.多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测.结果表明S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核.