小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达载体。方法:PCR扩增Rv1884基因,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);经酶切鉴定正确的重组质粒酶以阳离子聚合物转染P815细胞后,以RT-PCR方法检测mRNA的表达,以间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组质粒pcDNA-Rv1884;RT-PCR结果证明Rv1884可在P815细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有Rv1884蛋白的细胞着染。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的真核表达载体pcDNA-Rv1884,Rv1884基因可以在P815细胞中表达。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒构建及其在人成骨样细胞SaOS-2细胞中的表达*

目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)的pcDNA3.1(+)真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-CTGF),并检测其在人成骨样细胞SaOS-2中的表达,为进一步研究CTGF基因在骨发育和骨修复中的机制提供技术支撑。方法:采用PCR方法体外克隆CTGF基因全序列,将其用同源重组技术连接到线性pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并对该质粒进行测序鉴定;鉴定无误后转染至SaOS-2细胞中,观察其48 h的表达情况。结果:基因测序证实pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达重组质粒构建成功,与对照组相比,转染SaOS-2细胞48 h后的CTGF表达水平显著上调,达到对照组的4.8×10⁵倍(P＜0.01)。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并能在人成骨样细胞SaOS-2中稳定表达,为深入研究CTGF基因对骨生成的调控机制奠定了基础。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

人胃癌细胞系中FHIT基因mRNA的表达及pcDNA3．1-FHIT的构建与转染

目的:检测人胃癌细胞系中FHIT基因mRNA的表达状况及构建pcDNA3.1-FI-IIT真核表达载体.方法:RT-PCR法检测三种不同类型人胃癌细胞系中FHIT基因mRNA的表达,构建真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT,通过酶切法、PCR扩增法和DNA序列分析鉴定重组质粒后,用脂质体转染至FHIT基因mR.NA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45,经G418筛选后RT-PCR鉴定.结果:FHIT基因在人胃癌细胞系BGC-823中呈阳性表达,在MGC-803、MKN-45细胞系中呈阴性表达.FHIT基因cDNA正确克隆到真核细胞表达栽体pcDNA3.1中,并成功转染FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45.结论:FHIT基因在不同类型人胃癌细胞系中表达各异.成功构建pcDNA3.1-FHIT,并转染到FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45,使其唧T基因阳性表达.     

人乳头瘤病毒l6型E6-E7融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人乳头瘤病毒l6型(HPV16)E6-E7融合蛋白真核表达载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E6-E7基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,双酶切及测序鉴定。将质粒转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E6-E7基因在HeLa细胞中的表达。提取质粒免疫小鼠,利用免疫组化方法检测在其肌肉组织中的表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7;在转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7的细胞中检测到HPV16 E6-E7基因。在免疫该质粒的小鼠肌肉组织中可以检测到该质粒的蛋白表达。结论成功的构建的了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,该载体能在HeLa细胞内以及小鼠骨骼肌细胞内有效表达。     

汉滩病毒S基因及其5'端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒(HTNV)S基因及其5'端表达的意义,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础.设计2套引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S基因全读码框(37-1326bp)及S基因5'端(37-501bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体,并通过脂质体转染至Vero细胞中,进行了瞬时表达.间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N在Vero细胞中的表达.pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义.     

西方马脑炎核酸疫苗表达载体构建及免疫原性研究

为构建西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)结构基因C-E3-E2-6k-E1重组真核表达载体,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性.采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-C-E,用酶切和测序分析方法鉴定正确后,重组质粒被转染到293T细胞,经电镜检测和间接免疫荧光方法证明基因可以表达后,用该重组质粒免疫小鼠,免疫后检测实验组小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和血清中细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度,以上实验组各项免疫指标与对照组相比差异均显著(P＜ 0.05);ELISA方法检测实验组小鼠血清中WEEV的IgG抗体效价是1∶16.研究结果表明重组质粒pcDNA3.1-C-E可在细胞中获得瞬时表达,并且重组质粒作为核酸疫苗能够刺激小鼠产生免疫反应,具有较强免疫原性,为今后WEEV核酸疫苗研制奠定了良好基础.     

GALNT14对人乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响

构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,经G418筛选并建立稳定转染GALNT14细胞株.应用半定量RT-PCR、Western blot检测稳定细胞株GALNT14 mRNA及蛋白表达水平,细胞划痕修复及穿膜试验检测GALNT14基因对MCF-7迁移能力的影响,同时RT-PCR检测GALNT14对MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF等肿瘤浸润转移相关因子表达的影响.结果显示成功构建了真核重组表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,经RT-PCR和Western blot检测显示成功获得了稳定表达GALNT14的MCF-7细胞株;GALNT14能够提高MCF-7细胞株的迁移能力,且能增加侵袭转移相关因子MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF的表达.结论:GALNT14可明显促进MCF-7细胞的迁移,可能在肿瘤侵袭转移中起重要作用.     

人源跨膜蛋白43(TMEM43)的检测、细胞内定位及体外真核表达

为探究人源跨膜蛋白43(TMEM43)基因含量、定位分布及体外真核表达情况,利用RT-PCR及Western blot方法分别检测内源MRC-5和HEK293细胞内TMEM43基因及其蛋白表达情况,采用间接免疫荧光实验进一步分析其在MRC-5细胞内的分布;构建重组表达载体pcDNA3.1-EGFP-TMEM43,转染至HEK293细胞内检测外源TMEM43在HEK293细胞内的基因和蛋白表达情况。结果显示,基因水平TMEM43在MRC-5细胞内的表达明显高于HEK293细胞,蛋白水平仅能检测到MRC-5细胞内TMEM43的表达。重组表达质粒pcDNA3.1-EGFP-TMEM43转染HEK293细胞后,基因水平TMEM43表达显著升高, Western blot可检测到转染后细胞内TMEM43蛋白成功表达。结果表明,不同细胞表达TMEM43含量存在差异,肺来源细胞内TMEM43的表达明显高于肾来源的细胞;构建的重组载体pcDNA3.1-EGFP-TMEM43可成功转染HEK293细胞并表达。该研究为TMEM43结构及功能、与疾病相关机理的进一步探究提供了实验依据。     

小鼠EVL 基因的克隆和真核表达载体的构建

目的:构建小鼠EVL(Ena/VASP like)基因的真核表达载体,为深入研究EVL的功能奠定基础.方法:采用PCR方法,从小鼠cDNA文库中,扩增出1245bp的EVL编码区片段,经电泳、胶回收后连接入pMD- 18T载体中,测序鉴定正确.用BamHI和HincⅡ双酶切,定向克隆EVL编码区片段到真核表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切鉴定重组质粒正确后.将重组质粒转染入HELA细胞中,以RT-PCR检测EVL的mRNA的表达,以Western Blot检测EVL蛋白的表达.结果:酶切鉴定结果显示小鼠EVL编码区基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1中;RT-PCR和Western Blot结果以及免疫荧光染色显示Hela细胞中有EVL的mRNA和蛋白的表达.结论:成功获得pcDNA3.1 -EVL的真核表达载体,为进一步深入研究EVL蛋白的功能奠定了基础.     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

C反应蛋白真核表达质粒的构建、表达及其对小鼠血管平滑肌细胞TNF-α表达的影响

目的构建小鼠C-反应蛋白基因重组质粒pIRES-CRP,观测其对血管平滑肌细胞TNF-α表达的影响。方法用RT-PCR法,以小鼠肝组织RNA为模板,扩增获得编码C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的全长基因。将CRP基因克隆入真核表达质粒pIRES中,构建重组真核表达质粒pIRES-CRP。将重组质粒转染HeLa细胞,通过RT-PCR法检测CRPmRNA的表达,Western blot检测CRP蛋白的表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,通过Western blot检测CRP对TNF-α表达的影响。结果经酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明,所克隆的CRP基因与报道结果完全一致,重组体的连接方向正确,阅读框与预期完全一致,真核表达质粒pIRES-CRP构建成功。将重组质粒pIRES-CRP瞬时转染Hela细胞,通过RT-PCR和Western blot证实CRP基因得到表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,TNF-α的表达明显高于空白对照组和空载体组(P<0.01)。结论成功构建小鼠CRP基因重组质粒pIRES-CRP,CRP基因能在人子宫颈癌Hela细胞中正常转录和翻译,表达的蛋白能与CRP的特异抗体反应。CRP能明显上调小鼠血管平滑肌细胞TNF-α的表达,这为解释CRP在冠状动脉的形成过程中起着促炎作用提供了新的实验依据。     

表达血管内皮生长因子-siRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建及其应用研究

构建了新型联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK,研究其在人胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达和杀伤作用.构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)的干扰质粒pGenesil-VEGF-siRNA,采用PCR法从中扩增siRNA表达框(含U6启动子),亚克隆至双自杀基因载体pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK,构建联合基因质粒pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK;通过酶切、测序等鉴定重组质粒;以磷酸钙纳米颗粒为载体,将干扰质粒、双自杀基因质粒及联合基因质粒转染SGC7901细胞,RT-PCR、Western-blot验证目的基因表达;MTT法检测转染细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性.结果表明:酶切及测序证实联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK构建成功;SGC7901细胞转染联合基因质粒后,RT-PCR、Western-blot证实融合自杀基因表达,而VEGF基因表达下调;在前体药物5-FC作用下,转染联合基因组细胞存活率最低,与其他组比较有统计学差异.成功构建联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-si...     

人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定

[目的]构建含人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的载体并进行真核表达、纯化和研究其对细胞增殖的影响。[方法]提取人Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法获得Lyn基因并克隆至pcDNA3.1(-)载体。经双酶切、PCR和测序方法鉴定后,将重组质粒瞬时转染HEK 293T细胞表达目的蛋白,应用组氨酸标签镍离子螯合磁珠纯化融合蛋白,通过Western Blot检测蛋白的表达及纯化,并用CCK-8法检测过表达Lyn后细胞增殖能力的变化。[结果]成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Lyn并进行瞬时表达和蛋白纯化,CCK-8法检测过表达Lyn的HEK 293T细胞的增殖能力显著性下降(P0.01)。[结论]Lyn在HEK 293T细胞中成功瞬时表达及纯化,并可以使细胞的增殖能力受到明显抑制,为稳定表达和深入研究其生物学功能及作用机制奠定基础。     

Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达

目的构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,转染人宫颈癌Hela细胞,用以探讨HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用。方法应用基因重组技术构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,通过脂质体介导将其转染入Hela细胞,倒置荧光显微镜观察转染效果,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果酶切鉴定结果显示含EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建成功,并能在Hela细胞中封闭HIF-1α蛋白的表达。结果 EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建及转染成功,封闭Hela细胞中HIF-1α蛋白的表达,为进一步研究HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用提供试验基础。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及表达

构建人整合素β3亚基全读码框(ORF)基因真核表达载体,为探讨整合素β3作为汉坦病毒(Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础.根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切和PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序,序列分析表明与公布的人整合素β3亚基ORF核苷酸序列基本一致,并通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达,经间接免疫荧光法检测证实pcDNA3.1-β3能在宿主细胞中高效表达.