生物素-亲和素系统及其应用(续二)

<正> 八、生物素衍生物 (一)生物素化大分子 用于生物素化的生物大分子物质最常见的是抗体。由于抗体分子上的氨基基团极易被活化生物素即生物素酸-N-羟基丁二酰亚胺(BNHS)所酰化,从而可使一个抗体分子接上多个抗生物素蛋白分子起反应。通常选用抗抗体(第二抗体)接上生物素,以便使用于不同的抗原-抗体反应体系。     

生物素-抗生物素系统免疫酶法用于乙型肝炎“e”系统检测的研究

近年来生物素-抗生物素系统(Biotin-Avidin-System)在免疫学技术中的应用,日益为国内、外学者所重视。这一技术的使用,大大提高了方法的灵敏度,为微量抗原和抗体的检测开辟了新的途径。我们在探讨这一新的技术中,运用标记抗生物素和生物素法(LAB法),检测乙型肝炎e系统,初步获得良好的效果,现报道如下:     

抗生物素蛋白-生物素免疫荧光技术检测细胞培养中增殖的甲型肝炎病毒抗原

检测细胞培养增殖甲型肝炎病毒抗原(HAAg)的敏感方法主要有直接免疫荧光(DIF),间接免疫荧光(IDIF),固相放射免疫(RIA)及放射免疫斑分析(RIFA)等。本文第一次报告用抗生物素蛋白-生物素(Avidin-Biotin)放大作用提高免疫荧光技术的敏感性应用在细胞培养中检测HAAg,生物素化抗甲肝IgG与抗生物素蛋白联结的荧光素偶合检测(BA-FA)与DIF比较,BA-FA不仅可获得背景清晰的荧光。而且快速、节省特异抗体,BA-FA特异性亦好。     

用生物素标记的葡萄球菌蛋白A(SPA)检测日本脑炎抗体

<正>自从亲和素和生物素特异性相互反应由Guesdon(1979)引入ELISA以来,此方法已被广泛采用为一种有用的技术,以检测和定量免疫球蛋白或抗原。用生物素标记的抗猪免疫球蛋白(Ig)抗体,结合酶标记亲和素结合物的ELISA,也已成功用到作者     

EV71与CA16双价灭活疫苗诱导小鼠免疫原性研究

目的评价EV71和CA16双价灭活疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫和细胞免疫应答。方法分别应用EV71和CA16双价疫苗、EV71和CA16单价疫苗按单针、两针(0,14 d)的程序免疫小鼠,采用细胞病变法检测血清第1针免疫后21 d时中和抗体效价,应用LUMINEX液相芯片技术检测小鼠脾单个核细胞体外经抗原刺激分泌细胞因子的水平。结果双价疫苗与EV71单价疫苗单针、两针免疫相比,EV71中和抗体几何平均值相近(118.8∶84.0;159.5∶156.8,P0.05)。双价疫苗与CA16单价疫苗单针免疫诱导的CA16中和抗体均为阴性;两针免疫CA16中和抗体几何平均值一致(30.0∶26.9,P0.05)。加强免疫7 d后,小鼠脾MNC经EV71抗原刺激,双价疫苗较EV71单价疫苗诱导Th2类细胞因子IL-4、5、6、10和炎症因子TNF-α的分泌水平显著增高(P=0.020,P=0.027,P=0.038,P=0.019,P=0.026);MNC经CA16抗原刺激,双价疫苗与CA16单价疫苗相比诱导细胞因子水平差异无统计学意义(P0.05)。结论双价疫苗可诱导与单价疫苗相似的中和抗体应答水平,并可提高Th2类细胞因子应答,研究为EV71和CA16双价灭活疫苗的研发提供了实验依据。     

利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质

传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法,涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理,该方法步骤繁琐,且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒pCDFDuet-1,将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶D(hexosaminidase D,HexD)的cDNA与生物素受体多肽(biotin acceptor peptide,BAP)DNA进行PCR拼接,连入pCDFDuet-1的多克隆位点1(multiple cloning site1,MCS1);将以大肠杆菌Trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶(biotin ligase,BirA)基因连入MCS2,构建重组质粒pCDFDuet-hexD-BAP-birA。初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,利用0.1 mmol/L的IPTG和80μmol/L的生物素进行诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤对HexD进行纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(60 kDa)和纯度(90%以上)。以anti-HexD和链霉亲和素-HRP为抗体,Western blot检测发现,HexD-BAP表达正确,且被生物素标记;同时以4-MU-O-GalNAc为荧光底物,检测到生物素化标记HexD的糖苷酶活性为3.6 nmol/(min·μg),与未标记HexD的活性(3.06 nmol/(min·μg))相当。结果表明,可以利用BirA及其受体多肽,通过共表达质粒pCDFDuet-1,一步转化、表达和纯化,在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记,且不改变目的蛋白的生物活性,可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究。     

用生物素—亲和素酶染色法检测流行性出血热病人血清抗体

目前,生物素—亲和素系统在微生物方面的应用主要局限于ELISA法。我们用生物素一亲和素酶染色法(BAPS)检测流行性出血热(EHF)患者血清抗体,获得满意结果。 用BAPS法检测10份EHF患者的抗体及滴度,用兔抗76-118血清作为已知阳性对照,同时以20份非EHF患者血清为阴性对照。首先分别将感染了流行性出血热病毒陈株、A9株、R22株的Verc-E6细胞固定于含12个憎水漆圈的载玻片上,于此三种抗原片上分别滴加上述待检血清,37℃湿盒30分钟,PBS-     

白术多糖对小鼠免疫功能调节的研究

目的将白术多糖作为抗原刺激小鼠免疫系统,探讨其对免疫功能调节作用,为多糖在免疫调节功能方面的应用开发及在药物鉴定方面的应用提供科学依据。方法分别给予小鼠自术多糖、可溶性淀粉多糖、伤寒多糖抗原刺激,检测小鼠血清中的相应抗体及交叉抗体,探讨补益类水溶性多糖对小鼠免疫功能的调节作用。结果多糖抗原均能刺激机体产生特异性IgG类抗体（P〈0.05）;也能在一定程度上激发非特异性IgG类抗体即交叉抗体的产生;但不激发病理性抗体产生（RF阴性）。结论补益类水溶性多糖能激发免疫反应与其他多糖可能有共同的途径和机制。     

生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定

建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。     

基于亲和素-生物素双夹心体系测定外源性蛋白血清动态浓度的非抗体依赖新方法

建立一种非抗体依赖的检测外源性蛋白多肽分子代谢动力学血清浓度及动态变化的新方法．链亲和素为捕获分子,加入待测生物素标记蛋白或合成肽,辣根过氧化物酶标记链亲和素为检测分子,构成链亲和素-生物素标记大分子-酶链亲和素的双夹心体系,并进行特异性、敏感性、准确性及稳定性评价．本检测体系灵敏度高,可达0.3125 μg/L,且可通过改变亲和素包被浓度调整检出敏感度与检测范围．准确性回收率为97.82%～107.92%,批内、批间变异系数分别< 5.76% 和< 8.42%,并成功应用在生物素标记人血清白蛋白(biotin-HSA)与生物素标记鸡卵黏蛋白(biotin-OVM)的小鼠血清浓度动态检测．本方法不依赖抗体与放射性核素,可望在外源性蛋白多肽大分子及其药物的体内定量检测和代谢动力学研究中广泛应用．     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

免疫反应动力学的几个数学模型

免疫系统对抗原刺激的应答过程非常复杂,由抗原刺激导致抗体产生的现象,可借助数学模型的研究获得有意义的结果。本文讨论有关抗体产生与免疫反应的动力学的问题,介绍有关的数学模型,并根据近斯免疫学研究的进展分析了若干模型。     

生物素标记庆大霉素耐药基因探针

采用低熔点琼脂糖挖块法回收源自澳大利亚的pDG0103的2．0kb的BamHI—HindIII片段(携带2”-0-腺苷转移酶[ANT(2”)]基因)和自建的pBY102的4．9kb的Pst1-EcoRI片段。以缺口平移法,用生物素-7-dATP进行标记,制备成探针。通过southern印迹杂交和菌落原位杂交,证明澳源的Gm—DNA探针与美国的探针同源,而与作者构建的Gm-DNA探针不同源。再以菌落原位杂交法,用生物素标记的上述两种探针分别检测1 06株庆大霉素(Gm)耐药的细菌,结果表明这些菌株携带的Gm钝化酶基因的类型不止一种。     

白细胞介素:可溶性免疫介质

<正>引言 炎症,微生物侵袭,抗原刺激和创伤能引起具有免疫应答能力的宿主产生复杂的生物学反应。该反应,在很大程度上是由淋巴网状内皮系统的效应和调节细胞介导的。特别是,胸腺依赖性淋巴细胞(T细胞),抗体形成淋巴细胞(B细胞)和巨噬细胞(MΦS)在宿主对抗原刺激和炎症的起始和持久反应上起着关键的作用。除了它们各     

用生物素-中性抗生物素蛋白结合导致的位阻来控制连接生物素的缓激肽生物活性(英)

缓激肽是一含有9个氨基酸残基的多肽,其残基序列为Arg¹-Pro²-Pro³-Gly⁴-Phe⁵-Ser⁶-Pro⁷-Phe⁸-Arg⁹-OH,在激肽释放酶的作用下, 从其大的前体多肽——激肽原而形成的.许多发病机理,如发炎、疼痛、哮喘等都与缓激肽有关. 它能与PC12细胞表面的受体作用,引起细胞器内的钙离子释放,在共焦显微镜下,通过观察钙指示剂Fluo-3荧光增加来监测缓激肽的生物活性.在这项研究中,利用固相肽合成方法合成了连接生物素的缓激肽,Biotin-Arg¹-Pro²-Pro³-Gly⁴-Phe⁵-Ser⁶-Pro⁷-Phe⁸-Arg⁹-OH,通过对其生物活性的研究发现：a.它能保持象天然的缓激肽那样的生物活性;b.由于中性抗生物素蛋白与连接的生物素的结合引起的空间位阻阻碍它与细胞表面受体的相互作用,从而抑制了它的生物活性;c.在有自由的生物素存在的条件下,自由生物素与连接生物素与中性抗生物素蛋白的竞争结合,能够使得与中性抗生物素蛋白结合的连接生物素的缓激肽从抗生物素蛋白上脱离,因而恢复其生物活性.因此,可利用生物素和抗生物素蛋白来控制连接生物素的缓激肽的生物活性.这对于研究生物体系中生物活性的结构相关性具有重要的意义.     

全球抗体药物研发态势分析

<正>1引言抗体(antibody,Ab)是指浆细胞(效应B细胞)在抗原刺激下产生并释放的可与其发生特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig),是机体免疫系统的一个重要组成部分。根据抗体结合抗原决定簇的数量,抗体一般可以分为单克隆抗体(monoclonal antibody)和多克隆抗体(polyclonal antibody)。其中,单克隆抗体及其与药物的偶联物因其高特异性、高有效性和高安全性等特点,形象地被称为"生物导弹",现有的抗体药物大多属于此类抗体。     

组蛋白的生物素酰化修饰

组蛋白修饰对基因表达的表观遗传学调控起着重要作用。组蛋白生物素酰化修饰是近年来新发现的一种组蛋白修饰,具有重要的生物学功能。有证据表明组蛋白生物素酰化在细胞增殖、DNA修复、维持基因组稳定等方面发挥作用。组蛋白的生物素酰化修饰是由羧化全酶合成酶与组蛋白直接相互作用的结果。本文主要介绍了组蛋白生物素酰化发现的过程,并对近年来在组蛋白生物素酰化催化机制和组蛋白生物素酰化功能方面的研究进展进行了综述,最后对组蛋白生物素酰化研究领域存在的问题进行了探讨。     

白色念珠菌摄取生物素的机制研究

本文进一步实验显示处于生物素饥饿状态的白色念珠菌摄取生物素具可饱合性和特异性。从饱合曲线测算出主动摄入生物素的半数最大初速率（１／２Ｖｍａｘ）所需生物素浓度,即Ｋｍ值为０７９±０１１（平均数±标准差,ｎ＝８）;叠氮钠（５ｍＭｏｌ／Ｌ）处理后,其Ｋｍ值增到２３９±０６４μｍＭｏｌ／Ｌ（平均数±标准差,ｎ＝３）。生物素之结构同源分子,如脱硫生物素、生物胞素、甲基酯生物素和对硝基苯酯生物素等竞争性抑制其主动摄取生物素,但是２亚氨基生物素却完全无抑制作用。在生物素摄入充足的白色念珠菌（在含２０ｎＭｏｌ／Ｌ生物素的培养基中生长）,生物素主要通过简单的弥散方式进入菌体内。由于血清中的生物素含量在ｐＭｏｌ／Ｌ到几个ｎＭｏｌ／Ｌ之间,白色念珠菌在体内可能通过主动摄取生物素机制满足其营养代谢需求。本研究为发展抗白色念珠菌新举措可能提供某种理论基础     

核酸探针生物素标记技术

在过去的杂交技术中,核酸多用~(32)P放射性同位素标记,但由于这些同位素半衰期短,价格昂贵,对人体有危害,因而限制了杂交技术的应用。近年来,许多研究者已成功地将生物素分子标记到     

生物素化ATP硫酸化酶的表达、固定化与应用

现代大规模焦测序技术的产生是DNA测序技术的一次革命,其关键技术之一是得到高活性的、固定于磁性微球表面的ATP硫酸化酶．生物素化的ATP硫酸化酶可以通过生物素与亲和素之间的特异结合特性固定在包被亲和素的磁性微球表面,但是利用化学修饰法将ATP硫酸化酶进行生物素化修饰很可能会影响酶的活性．利用融合表达策略,将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白C端87个氨基酸肽段(BCCP87)与ATP硫酸化酶在大肠杆菌内融合表达,经SDS-PAGE和Western blot分析,表达的融合蛋白分子质量约为64 ku,并且能够在大肠杆菌内被生物素化．生物素化的ATP硫酸化酶能够与亲和素包被的磁珠结合,固定后的ATP硫酸化酶具有活性,并且能够用于定量检测焦磷酸盐(PPi)和焦测序,为今后建立高通量大规模焦测序系统提供了一个有效的工具酶．