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α-半乳糖苷酶 总被引:3,自引:0,他引:3
最近各种媒体不断报道红血球类型可以通过酶处理进行转换 ,这对于输血和开拓血源有十分重要的意义 ,所用的酶是α 半乳糖苷酶。α 半乳糖苷酶 (α galactosidase ,α D galactosidegalactohydrolase ,EC 3.2 .1 .2 2 )能专一地催化α 半乳糖苷键的水解。它广泛存在于各种植物和动物体内 ,许多微生物如双歧杆菌 (Bifidobacterium)、黑曲霉菌 (Aspergillusniger) [1] 、大肠杆菌 (Escherichiacoli)K 1 2 1 [2 ]的抽提液中也发现有α 半乳糖苷酶的… 相似文献
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猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。 相似文献
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目的:观察脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶(GAL)在不同pH缓冲液、不同温度下的稳定性,以及不同离子及还原剂对酶活性的影响。方法:以GAL对单糖底物对硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)的活性为主要检测指标,观察不同离子及还原剂等对酶活性的影响;观察GAL在不同pH缓冲液中和不同温度下的稳定性。结果:钙离子、锌离子、钴离子和高浓度的锰离子增强酶的活性,DTT抑制酶的活性,螯合剂EDTA的加入提高了酶活性。GAL在pH4.6~7.5时保存1 h后稳定性很好,能保持最高活性的90%以上;在4℃~45℃下保存的稳定性最好,45℃开始活性下降。结论:GAL具有很好的温度稳定性和pH稳定性,使其适用于血型转变和异种移植。 相似文献
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重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究 总被引:7,自引:1,他引:6
α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80~150U/mL,蛋白浓度为3~4.5mg/mL,比活性约为20-30U/mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98%以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。 相似文献
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目的:探讨脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面α-Gal抗原的作用。方法:用不同浓度的α-半乳糖苷酶酶解猪红细胞、猪胚肾细胞PK15、猪睾丸细胞ST和原代培养的猪成纤维细胞上的α-Gal抗原,酶解温度为26℃,作用时间为2 h;用25μg/m L的FITC-IB4凝集素标记酶解前后的细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面α-Gal抗原的清除率。结果:流式细胞检测结果表明,不同组织来源的猪细胞表面的α-Gal抗原的表达量明显不同,所需酶的剂量也不同,但其表面的α-Gal抗原均能被α-半乳糖苷酶清除。结论:脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶可以清除猪细胞表面的α-Gal抗原,提示该酶对降低异种移植引起的超急性排斥反应有重要意义。 相似文献
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基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究 总被引:11,自引:0,他引:11
在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。 相似文献
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在获得可分泌表达α-半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上,尝试了基因工程α-半乳糖苷酶在5 L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。在4 L无机盐培养基中接种0.4 L pPIC9K-Gal/GS115培养物,最终得到3.5 L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为2.1 g/L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点,设计了如下的纯化流程:离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带,总回收率41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明,从发酵液中纯化的α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α-半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。 相似文献
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反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应 相似文献
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α-半乳糖苷酶进行氨基酸组分分析,结果为含有较多的酸性及巯水性氨基酸,较少的组氨酸、酪氨酸及半胱氨酸。 用几种蛋白质侧链修饰试剂对α-半乳糖苷酶进行化学修饰。在一定条件下,当巯基及酪氨酸残基分别被NEM、IAA及NAI修饰后,酶活力不受影响,说明这些基团与活力无关。当羟基、组氨酸及色氨酸残基分别被EDC、DEP、NBS及HNBB修饰后,酶活力大幅度下降,说明这些基团或者参与了酯催化作用或者位于酯活性位区附近。 相似文献
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人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应 总被引:3,自引:0,他引:3
半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 ,探讨克服异种移植HAR提供了技术途径 相似文献
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《生物技术通报》2017,(8)
3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn~(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。 相似文献
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观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性.在有选择压力(Kan+)条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测.结果表明细菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100%,但诱导过程中质粒易丢失.第20、40和60代提取质粒进行酶切检查,酶切图谱没有改变.DNA测序未见α-半乳糖苷酶基因变异.原代菌株及第20、40和60代菌株经诱导培养,其α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无明显差异.说明α-半乳糖苷酶工程菌株在平板传代中具有良好的遗传稳定性 相似文献
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用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础. 相似文献