PKIB抑制PKA活性调节细胞衰老

人cAMP依赖型蛋白激酶B抑制剂(PKIB)是一种新的耐热蛋白.实验证明,PKIB对PKA催化亚单位具有抑制作用.为研究PKIB在细胞衰老中的功能,以年轻和年老人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS细胞株)为实验对象,通过实时 PCR发现,在年老细胞中,PKIB表达高于年轻细胞;用PKA活化剂处理年轻和年老细胞,结果显示,在年老细胞中PKA活性变化较年轻细胞小.通过免疫共沉淀实验证实,在年老细胞中,PKIB与PKA催化亚单位结合较年轻细胞中多;进一步通过在年轻细胞中过表达PKIB,检测细胞PKA活性,发现PKA活性明显降低,进一步证实了在人胚肺二倍体成纤维细胞中PKIB对PKA活性的抑制作用;利用Western实验结果证实,PKA催化亚单位在年轻细胞中的表达高于年老细胞.以上结果证明,在2BS细胞中,PKA活性受PKIB的抑制;这种抑制作用与细胞的衰老有一定的关联作用.     

HMG盒蛋白1抑制巨噬细胞移动抑制因子启动子的转录激活

HMG盒蛋白1（HMG box-containing protein 1, HBP1）是一种转录抑制因子. HBP1表达上调可抑制肿瘤细胞的增殖和转移,并且在肿瘤细胞中HBP1常常发生丢失或转位,这表明HBP1是一种抑癌基因. HBP1所调节的靶基因无疑将为HBP1的肿瘤抑制机制提供新的线索.本研究通过生物信息学分析发现,在促细胞增殖基因 巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）启动子区域-811 bp至-792 bp发现高亲和力的HBP1反应元件.缺失和突变分析表明,HBP1通过该元件抑制MIF启动子活性.此外,免疫共沉淀研究显示,HBP1在细胞内与该元件结合,并且抑制MIF的转录.功能分析进一步证实,在细胞培养液中加入重组MIF可部分消除HBP1对大肠癌细胞LOVO的抑制作用.这些结果提示,MIF是HBP1的一个靶基因.HBP1通过抑制促细胞增殖基因MIF的表达抑制肿瘤细胞生长.     

肾癌相关基因CXorf36的克隆及亚定位研究

揈应用生物信息学分析,筛选获得1个肾癌组织中高表达,而在癌旁正常组织中低表达的新基因CXorf36(chromosome X open reading frame 36),并用RT PCR方法,在组织和细胞系中加以验证.与肾癌组织相比，3种肾癌细胞系中该基因mRNA的表达丰度很低.为观察CXorf36基因表达产物在哺乳动物细胞内的亚定位,构建了pEGFP N1-CXorf36融合表达载体,转染786-O细胞,其融合蛋白均匀分布于细胞浆.氨基酸序列比对分析显示, CXorf36蛋白与小鼠来源的猜测蛋白LOC75905具有79%的同源性,而小鼠LOC75905蛋白可能是一种水解酶.因此,推测CXorf36蛋白是通过其水解酶活性，在肿瘤的发生、生长或侵袭过程中发挥重要作用.进一步关于CXorf36基因功能的研究，如其在肿瘤组织中的定位、对细胞生物学功能的影响，及其寻找相互作用分子的实验等仍在进行中.     

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85 %以上     

胸苷激酶基因在人二倍体成纤维细胞衰老过程中的表达调控

为研究人胸苷激酶 (humanthymidinekinase ,hTK)基因在复制衰老细胞及早衰细胞中表达下调的分子机制 ,构建了含hTK启动子的荧光素酶报告基因载体 .转染结果显示 ,复制衰老细胞与早衰细胞中hTK启动子的转录活性比年轻细胞中下降了近 3倍 ,表明转录水平的调控是hTK在衰老细胞中表达下降的主要调控机制 .定点突变的结果显示 ,转录因子Sp1、NF Y结合位点的突变可使hTK启动子活性降低近 5 0 % ,而E2F结合位点的突变可使其活性升高 2倍多 ,提示Sp1和NF Y是hTK基因的转录活化因子 ,而E2F为转录抑制因子 .电泳迁移率变更实验发现 ,与年轻细胞相比 ,Sp1、NF Y与hTK启动子的DNA结合活性在复制衰老细胞和早衰细胞中无明显改变 ,提示转录活化因子Sp1、NF Y并非hTK在衰老细胞中下调的主要因素 .染色质免疫共沉淀结果显示 ,在细胞内Rb结合在hTK启动子上 ,且同年轻细胞相比 ,复制衰老细胞及早衰细胞中的hTK启动子结合着更多的Rb ,这提示细胞衰老过程中Rb的去磷酸化可能与hTK基因在衰老过程中的下调有关 .     

垂体瘤转化基因1(PTTG1)的表达变化对人前列腺癌细胞LNCaP生长增殖的影响

垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)具有促进肿瘤生长和转移的作用.通过上调或下调基因表达的策略,观察PTTG1基因对人前列腺癌细胞株LNCaP细胞生长增殖的影响.利用PCR技术分离出PTTG1全长cDNA,分别正向和反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP,重组载体分别命名为正义PTTG1-S/pIRES2-EGFP(即pI-P-S)和反义PTTG1-AS/pIRES2-EGFP(即pI-P-AS),将这两种重组载体稳定转染LNCaP细胞,通过流式细胞仪和MTT法分别检测了细胞周期和细胞增殖的情况.转染正义PTTG1后处于S期和G2期的细胞明显增加,细胞生长增殖能力增强;相反,转染反义PTTG1后处于S期和G2期细胞明显减少,细胞生长增殖能力减弱(P<0.05).结果表明,PTTG1能明显改变人前列腺癌细胞株LNCaP的细胞周期和细胞生长增殖能力,它的异常表达可能参与前列腺癌细胞生长增殖过程.     

DNA去甲基化对细胞衰老的影响

５－氮杂胞嘧啶为ＤＮＡ甲基化转移产的抑制剂,用它处理细胞,使基因组ＤＮＡ去甲基化,结果发现,经５ａＺａＣ处理后的细胞衰老进程明显加快,这从另一侧面反映了ＤＮＡ甲基化与细胞衰老的关系。     

有丝分裂诱导基因6(MIG-6)可诱导人成纤维细胞发生提前衰老

年老细胞许多基因表达发生变化,其中有些基因的表达可以诱导成纤维细胞早衰.癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senescence,OIS)是由一些连续癌症基因的信号,以阻止细胞增殖造成的反应.有丝分裂诱导基因6(mitogen-inducible gene-6,MIG-6)是一个抑癌基因,是ErbB RTK通路的负调控因子,抑制肿瘤细胞增殖.本文以人胚肺二倍体成纤维细胞为对象,研究MIG-6蛋白在细胞衰老中的作用.通过Western印迹发现,在老年细胞中MIG-6表达升高.利用逆转录病毒载体将MIG-6基因转入年轻的人胚肺二倍体成纤维细胞中,通过Western印迹方法检测是否过表达MIG-6,然后通过SA-β-gal染色检测其阳性率,发现转染MIG-6基因后的成纤维细胞SA-β-gal染色率明显高于对照组,生长缓慢.实验结果证实,MIG-6蛋白可以诱导人二倍体成纤维细胞提前衰老.     

NF-κB对PPARδ基因的转录调控

过氧化物酶体增殖因子活化受体δ基因(PPARδ)与结直肠癌相关，但其转录调控机制尚不清楚.本研究构建了PPARδ基因的启动子荧光素酶报告基因载体，用删除法定位了启动子活性区域，并通过核酸重叠法和电泳迁移率变更实验,将该区域缩小到30 bp,预测该区域可能起作用的转录因子结合位点;通过启动子定点突变分析和核酸诱骗实验，发现真正起作用的是-156～-127区域内NF-κB的结合位点.电泳迁移率变更法和超迁移分析实验,证实NF-κB能够与该区域结合，并且在抑制NF-κB的DNA结合活性后，PPARδ mRNA的表达明显降低.这些实验表明，在Lovo细胞中，转录因子NF-κB参与了PPARδ的表达调控.     

H2O2诱导的2BS早老细胞中自噬体增多

自噬在细胞复制性衰老中起着重要的作用.然而,早老细胞中的自噬现象基本无相关的报道.本文通过外源性过氧化氢(H₂O₂)的诱导,构建人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS细胞）早老模型.首先,通过SA-β-gal染色,验证细胞早老;从形态学和特异标志分子及雷帕霉素作用的靶位点(mTOR)信号通路不同角度检测自噬的变化,其中形态学检测包括丹（磺）酰戊二胺(MDC)自噬分子定量法及电镜自噬超微结构的观察;特异标志分子LC3的检测包括GFP-LC3自噬定位法和免疫印迹法检测LC3;及检测mTOR信号通路下游激酶p70S6蛋白的表达变化.结果表明,过氧化氢诱导的早老细胞中自噬体相对年轻细胞明显增多,且具有保护早老细胞的作用.