人和大鼠自噬相关新基因WIPI- 3 的电子克隆和序列分析

目的：人和大鼠WIPI-3基因的电子克隆和序列分析。方法：综合运用基因电子拼接和比较基因组分析等生物信息学手段进行新基因的电子克隆和注释。通过拼接CR593190、NM 019613和BC00097 cDNA序列获得人WIPI-3 cDNA全长序列,通过拼接EST序列CB727439、CB737031、BF557312、BG663387和预测的CDS获得大鼠WIPI3基因的cDNA序列。结果：成功克隆了人和大鼠自噬相关新基因WIPI-3的cDNA,上述两个新基因序列均得到了人类基因组序列和EST序列的双重支持,另外经RT-PCR验证电子克隆的基因序列也是正确的,而且序列均已被GenBank收录,其编号分别为：AM182326和NM-001039587。其中,人WIPI-3基因修正了目前基因库中注释的WIPI-3序列,而大鼠基因则是国际上首次克隆,井被确定为参考序列。结论：基因电子拼接结合种属同源基因比较分析,可大大提高电子克隆的精确性,这种方法可有效用于新基因的克隆和注释。     

中华蜜蜂工蜂cDNA文库的构建及ESTs测序分析

【目的】为了解中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂的抗逆性,构建了中华蜜蜂工蜂的cDNA文库,并对文库质量进行分析。【方法】本研究利用SMART技术构建了中华蜜蜂工蜂的全长cDNA文库。【结果】文库库容为3.6×106 cfu/m L,文库重组率为97%,插入片段长度多数分布在1 000 bp左右。挑取cDNA克隆进行EST测序,共进行了306个成功反应,软件拼接共得到234个单基因簇(Unigene),其中包括207个单拷贝(Singletons)序列及27个重叠群(Contigs)。使用Blastx将这些序列同Gen Bank等数据库进行查询、比对和注释,结果显示141条序列有相关同源性,其他序列没有明显的同源性,这也为我们发现新功能基因提供了可靠依据。【结论】此文库的构建在中华蜜蜂功能基因的分离、克隆、筛选以及基因功能研究等方面具有重要作用。     

cDNA(EST)文库的高通量生物信息学分析体系的构建与应用

应用生物信息学方法,构建了一套针对cDNA或EST文库的高通量、自动化分析体系,CLASP(cDNA Library Analysis SystemPrimary)。CLASP基于Linux操作系统,主要由Perl程序构成。它以cDNA文库(ESTs)序列为分析对象,具有自动查找序列同源基因并进行染色体定位(包括细胞遗传学定位和SIS定位)、EST自动延伸等功能;并对不同来源序列进行聚类分析。应用该体系对3对肺癌相关抑制性消减杂交(SSH)cDNA文库进行了分析。结果在所有3对文库的2083条EST中有1492条找到了同源基因,其中1365条得到染色体定位。对所余591条未知基因的EST进行了电子延伸,其中有214条EST得到不同程度的延伸。对上述cDNA文库中已知基因的EST以及电子延伸后的EST再分别进行聚类分析,而后综合两个聚类分析的结果,由此可发现不同文库间的共同与差异表达基因,可用于特定性状相关的基因功能预测。     

基于PC/Linux的核酸序列电子延伸系统的构建及其应用

新基因全长cDNA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。人类基因组计划及其相关计划的实施导致了大量表达序列标签(EST)的产生。利用一定的生物信息学算法,这些EST序列往往可用来对新基因片段进行延伸。采用Linux操作系统,利用Blast软件和Phrap软件以及EST数据库在微机上构建了EST序列的电子延伸系统,并对来自于人胎肝的11386条EST序列和511条插入片段全长cDNA序列进行了电子延伸,结果显示8373条EST序列和389条插入片段全长cDNA序列得到了程度不等的延伸,部分结果通过RACE实验得到证实。该套系统可高效地、规模化进行EST序列的延伸,可为通过实验获得新基因全长cDNA序列提供重要线索。 Abstract:Normally it is difficult to obtain full-length cDNA sequence of novel genes.More and more expressed sequence tags(ESTs) have been obtained since the start-up of human genome project.Powerful system is badly needed for data mining on these EST sequences.Based on a personal computer coupled with Linux operating system and EST database,the Blast software and Phrap software were used to construct a platform for in silico elongation of ESTs in our lab.The performance was tested using 11386 EST sequences and 511 partial-length cDNA sequences.Results demonstrated that 8373 EST and 389 cDNA sequence were elongated using this system.Thus the platform seems to be a fast way for full-length cDNA sequence cloning of new genes.     

一个东亚钳蝎蝎毒素BmTXKβ基因的克隆及其基因表达调控

从东亚钳蝎 (ButhusmartensiiKarsch ,BmK)毒腺组织cDNA文库中分离的长链钾通道毒素BmTXKβcDNA序列 ,克隆了BmTXKβ基因组序列 .BmTXKβ基因含有一个长度为 886bp的内含子 ,定位于BmTXKβ成熟肽中 ,与其它蝎毒素基因内含子定位于信号肽的基因结构不同 .并且 ,BmTXKβ基因的内含子特征也与其它蝎毒素基因不同 .研究结果从基因水平上证实了BmTXKβ是一个新的蝎毒素样肽 .以BmTXKβcDNA序列为探针与蝎基因组DNASouthern杂交出现 2条特异性杂交带 .杂交结果为蝎毒素基因可能通过DNA重排、多拷贝或多基因家族来调控基因表达提供了证据 .     

甘蔗ATP合酶基因的电子克隆及生物信息学分析

目的:运用电子克隆的方法获得甘蔗中的ATP合酶基因。方法:以小麦中一个ATP合酶基因为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行聚类分析、拼接组装和延长。结果:获得一个ATP合酶基因SATPC1的cDNA序列全长,该序列长1 415bp,包含一个完整的1 077bp的ORF,编码358个氨基酸,且与水稻、玉米、高粱和葡萄等其他植物的ATP合酶具有高度的同源性。结论:电子克隆获得的cDNA序列为完整的甘蔗ATP合酶基因全长cDNA。     

悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库的构建与鉴定

运用SMART 技术构建了悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库.经检测,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500 bp～2000 bp 之间;把双链cDNA通过T/A克隆、随机挑选阳性克隆并测序后,得到1条752 bp的全长cDNA序列.以该文库为模板,用依据这条全长cDNA序列设计的基因特异性引物与接头引物进行RACE, 3'RACE 和5'RACE的产物拼接后的全长序列与上述全长cDNA序列一致.结果表明,该文库适于用RACE方法从中分离在悦目金蛛丝腺中表达基因的全长cDNA.本文还对SMART 技术的特点和局限性进行了讨论.     

新疆荒漠昆虫光滑鳖甲cDNA文库的构建及功能基因筛选

以过冬后早春的新疆荒漠拟步甲属昆虫光滑鳖甲(Anatolica Polita borealis)成虫为研究材料,应用SMARTTM cDNA Library Construction技术,通过总RNA提取,反转录合成cDNA,定向构建至噬菌体载体λTripEx2,经体外包装构建了光滑鳖甲的cDNA表达文库。测试结果表明库容量为2.2×106,重组率为84.8%。通过对cDNA文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得28个光滑鳖甲表达序列标签(ESTs),包括17个EST(60.7%)与NCBI中已注册的已知功能基因相似性较高,另外的11个EST(39.3%)则没有发现与之相似的序列,推测可能是功能未知的新基因。同时,利用PCR扩增文库技术从cDNA文库中克隆获得了光滑鳖甲的抗冻蛋白基因,初步表明光滑鳖甲cDNA表达文库构建的成功,为深入研究新疆荒漠昆虫的抗冻机理及发现新的昆虫功能基因奠定了基础。     

青杄均一化cDNA文库构建及EST序列分析

以青杄花粉和针叶为材料,将青杄全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了其非剪切型全长cDNA原始文库,利用基因组DNA饱和杂交技术对原始cDNA文库进行均一化处理,构建青杄的均一化全长cDNA文库。文库的总库容量为1.1×106CFU/mL,平均插入片段长度大于1.0 kb,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,青杄高丰度表达基因EF1-α在均一化cDNA文库中的表达量下降了约41倍。接着对文库中随机的5 144个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressedsequence tag)序列为5 144条,经拼接共获得单一基因(unigene)为2 717个,其中包括片段重叠群(contig)628个和单一EST序列(singlet)2 089个。NCBI同源比对分析表明,其中1 887个序列unigenes获得分子功能注释,这些EST涉及细胞生长、信号转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。     

The cyclic peptide synthetase catalyzing HC-toxin production in the filamentous fungus Cochliobolus carbonum is encoded by a 15.7-kilobase open reading frame.

Race 1 of Cochliobolus carbonum, a fungal plant pathogen, owes its exceptional virulence on certain genotypes of maize to the production of HC-toxin, a cyclic tetrapeptide. Production of HC-toxin is controlled by a single known gene, TOX2. Race 1, but not races that do not make HC-toxin, contains two copies of a 22-kilobase (kb) region of chromosomal DNA that is required for HC-toxin biosynthesis and hence virulence. We have sequenced this 22-kb region and here show that it contains an open reading frame of 15.7 kb that encodes a multifunctional cyclic peptide synthetase of potential M(r)574,620. This gene, called HTS1, apparently contains no introns. The predicted gene product, HC-toxin synthetase (HTS), contains four amino acid-binding (adenylate-forming) domains that are highly similar to those found in other cyclic peptide synthetases and other adenylate-binding enzymes. The DNA sequence encodes tryptic peptides derived from two HC-toxin biosynthetic enzymes, HC-toxin synthetase 1 (HTS-1) and HC-toxin synthetase 2 (HTS-2), indicating that these two enzymes exist in vivo as part of a single polypeptide. Consistent with this, in some enzyme preparations antibodies against the enzyme HTS-2, which was originally purified as a protein with a subunit M(r) of 160,000, recognize a protein with an estimated subunit M(r) greater than 480,000.     

绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其毛壳菌转化*

利用PCR方法从Trichoderma viride的基因组DNA中克隆了一个42kDa的内切几丁质酶基因,扩增的长度为1672bp,其中包含了启动子和mRNA的编码区。将该基因与来自构巢曲霉的色氨酸启动子相连后,通过原生质体转化将该基因导入球壳毛壳菌CG10。内切几丁质酶活性的测定结果表明,约1/3转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高。本实验为利用基因工程方法提高毛壳菌的生防能力打下了较好的基础。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

球毛壳菌60S核糖体蛋白L10a基因克隆与特性分析

用粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）XP_322380和赤霉菌（Gibberella zeag）PH-1（EAA76971）的60S核糖体蛋白L10a基因（60S ribosomal protein L10a,RPL10a）蛋白序列对球毛壳菌（Chaetomium globosum）ESTs序列数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌RPL10a cDNA序列。cDNA序列长765bp,开放阅读框654bp,编码217个氨基酸组成的多肽,蛋白分了量为23．9kD。BlastP分析表明该基因氨基酸序列与粗糙脉胞菌相似最高为89％;与玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）相似性最低为78％。cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录（登录号分别为AY669070,AAT74578）。     

The genus Chaetomium in Iran, a phylogenetic study including six new species

Twenty-one species of Chaetomium known from Iran were compared on the basis of morphological and molecular characters. Six new species are recognized, five isolated from cereals and one from nematode cysts. A combined sequence dataset of the ITS region, partial LSU rDNA, and β-tubulin gene sufficiently resolved five species groups of Chaetomium that are largely concordant with combined features of peridium structure, ascospore shape and germ pore position. Among the new species C. undulatulum is a close relative of C. globosum, C. rectangulare is close to C. elatum, C. interruptum and C. grande are close to C. megalocarpum, altogether forming the C. globosum species group. Chaetomium iranianum and C. truncatulum are members of the C. carinthiacum species group, characterized by spirally coiled ascomatal hairs and fusiform ascospores. A chrysosporium-like anamorph is newly described for C. acropullum.     

A eukaryotic alanine racemase gene involved in cyclic peptide biosynthesis

The cyclic tetrapeptide HC-toxin is an essential virulence determinant for the plant pathogenic fungus Cochliobolus carbonum and an inhibitor of histone deacetylase. The major form of HC-toxin contains the D-isomers of Ala and Pro. The non-ribosomal peptide synthetase that synthesizes HC-toxin has only one epimerizing domain for conversion of L-Pro to D-Pro; the source of D-Ala has remained unknown. Here we present the cloning and characterization of a new gene involved in HC-toxin biosynthesis, TOXG. TOXG is present only in HC-toxin-producing (Tox2(+)) isolates of C. carbonum. TOXG is able to support D-Ala-independent growth of a strain of Escherichia coli defective in D-Ala synthesis. A C. carbonum strain with both of its copies of TOXG mutated grows normally in culture, and although it no longer makes the three forms of HC-toxin that contain D-Ala, it still makes a minor form of HC-toxin that contains Gly in place of D-Ala. The addition of D-Ala to the culture medium restores production of the D-Ala-containing forms of HC-toxin by the toxG mutant. The toxG mutant has only partially reduced virulence. It is concluded that TOXG encodes an alanine racemase whose function is to synthesize D-Ala for incorporation into HC-toxin.     

球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa,XP_327967)和菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianu,P35143)的甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde 3_phosphatedehydrogenase,GAPDH)氨基酸序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌丝ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌GAPDH全长cDNA序列。该序列长1240bp,开放阅读框1014bp,编码337个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为36.1kD。用PCR方法克隆了该基因的DNA序列,序列长为1556bp,由2个内含子和3个外显子组成。BlastP同源性分析表明该基因与鹅掌柄孢壳(Podosporaanserine)同源性最高为95%;与米曲霉(Aspergillusoryzae)同源性最低为87%。GAPDH酵母转化子生物功能分析表明转化子对Na2CO3和高温有高的耐受性,证明GAPDH为抗胁迫基因。该基因的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY522719,AY593253,AAS01412)。     

球毛壳菌组蛋白H3基因克隆与特性分析

构建了球毛壳菌菌丝的cDNA文库,并获得了1410条ESTs序列,用里氏木霉(Hypocrea jecorina,AAM76068)和粗糙脉胞菌(Neurospora crassa,CAA25761)的组蛋白H3基因(Histone H3)蛋白序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌组蛋白H3cDNA序列。cDNA序列全长739bp,开放阅读框411bp,编码136个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为15.4kD。BlastP同源性分析表明该基因与里氏木霉同源性最高为100%;与地钱(Marchantia polymorpha)同源性最低为95%。三级结构预测表明,该蛋白C端为球状结构域,而N端结构对其发挥调控作用起重要作用。该基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY669068,AAT74576)。     

球毛壳菌(Chaetomium globosum)EST生物信息分析数据库的建立

用基因本体论（Cene Ontology,GO）中的相关的规范术语和BLAST分析结果来对球毛壳菌EST及CONTIG序列信息进行注释,利用GO的语义模型构建不同物种数据库之间的语义联接,在此基础上建立球毛壳菌EST生物信息分析数据库,在概念和联系层面上有效地解决了不同物种生物信息的整合问题,实现了对球毛壳菌生物信息学数据智能化的多重、复合和交叉检索。为球毛壳菌生物信息学的进一步研究奠定了坚实的基础。文中详细论述了基于GO的球毛壳菌EST生物信息学数据库的研究背景、建立过程、查询功能及其维护。