线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone和积雪草酸对朊病毒感染的神经细胞的治疗作用研究

朊病毒病(Prion diseases)是一类具有致死性、传染性和进行性的神经退行性疾病。研究发现朊病毒感染的细胞和动物模型中均存在着线粒体功能异常和氧化应激,这很有可能在朊病毒病发生发展中起重要作用。为探究线粒体靶向抗氧化剂对朊病毒感染是否具有一定的治疗作用,我们选出两种线粒体靶向抗氧化剂,以一定浓度作用于朊病毒感染神经细胞系,并观察细胞活性和线粒体功能的变化情况。结果显示,Mitoquinone(MitoQ)和积雪草酸(Asiatic acid,AA)这两种药物能够显著提高朊病毒感染细胞的活性,降低其活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,上调ATP5β的表达水平,提示这两种药物对朊病毒感染细胞有一定的治疗作用,本研究为朊病毒病发病机制以及治疗的研究提供了新的思路。     

心力衰竭大鼠心肌线粒体蛋白质组学研究

通过差速离心分离大鼠心肌线粒体,利用蛋白质组学技术构建正常大鼠心肌线粒体蛋白质组表达图谱;选用心肌梗死诱导的心力衰竭大鼠模型,分析比较心力衰竭时心肌线粒体蛋白质表达谱的改变.与正常对照组相比,心力衰竭大鼠心肌线粒体共有188个蛋白点的表达量发生了变化,其中有120个蛋白点表达上调2倍以上,有68个蛋白点表达下调1/2以上（P〈0.05）.对差异表达的蛋白点行胶内酶解后质谱鉴定和数据库检索,对蛋白质进行功能注释、亚细胞定位和生物信息学分析,其中有27个蛋白质涉及能量代谢和氧化应激,其中参与糖酵解及三羧酸循环的蛋白质（酶）表达上调,而参与OXPHOS复合体和脂肪酸代谢的蛋白质（酶）表达下调.研究结果表明,心力衰竭时心肌能量代谢模式发生了改变,底物选择从倾向于脂肪酸转为葡萄糖利用增加,糖酵解增强而脂肪酸氧化能力减低;为心肌缺血性损伤时线粒体结构和功能改变提供了分子依据,在蛋白质水平上阐述了线粒体在心力衰竭发展中的可能机制.     

线粒体的遗传

线粒体是真核细胞质中的一种细胞器,通常认为它是细胞呼吸的中心,它的主要功能是为生物提供生命活动所需要的能量。而呼吸作用包括两个不同途径:糖酵解和三羧酸循环。这两个过程都要由遗传基因控制下产生一系列的酶才能进行。已经明确:参与糖酵解各反应的酶是存在于细胞质中;而三羧酸循环和生物氧化的酶都在线粒体内。由于三羧酸循环在呼吸作用中占有较大的比重,而生物氧化是形成ATP的过程,所以,人们把线粒体比喻为细胞的“发电厂”。除了细菌和蓝藻未肯定外,所有的真核细     

HCMV感染单核细胞对细胞能量代谢的影响

该文旨在探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染人单核白血病细胞(THP-1)后对其能量代谢的影响。采用流式细胞仪、海马生物能量测定仪分别检测HCMV感染THP-1后细胞的存活率、有氧呼吸率(oxygen consumption rate,OCR)和细胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR);Western blot检测线粒体动力学相关蛋白;采用RNA-seq和质谱技术检测细胞代谢相关基因及蛋白表达水平。结果显示,HCMV感染24 h、48 h及72 h后,线粒体氧化磷酸化水平上升,糖酵解水平下降(P0.05);感染组线粒体融合相关蛋白MFN1、OPA1及OMA1表达量较对照组升高(P0.05);感染组ATP8A1、ATP6AP1L及ATP6V1C2等氧化磷酸化相关基因表达显著上调(P0.001),LDHA、ENO3及ENO1等糖酵解相关基因表达显著下调(P0.001);感染组ATP6V1A、ATP5O及PGP等细胞代谢相关蛋白表达显著上调(P0.01)。研究表明,HCMV感染THP-1细胞可能通过诱导线粒体融合及调控细胞能量代谢相关基因和蛋白的表达,促进细胞氧化磷酸化并抑制糖酵解水平。     

粟酒裂殖酵母中Atp11在线粒体中功能的研究

ATP是由ATP合酶复合体催化合成的,在线粒体呼吸过程中起着重要作用。旨在研究粟酒裂殖酵母中Atp11(SPAC3A12.12)在线粒体中的功能。利用同源重组的方法构建Δatp11突变体,观察Δatp11缺失菌在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基上的表型;通过生物信息学分析发现Atp11的N端含有一段由24个氨基酸残基组成的线粒体定位序列(MTS),为确定Atp11在细胞内的定位,在Atp11的C端添加一个GFP标签,观察绿色荧光在细胞内的位置;运用Western blotting检测atp11的缺失对线粒体基因组编码蛋白稳态性的影响。研究结果表明,Δatp11突变体在非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;GFP绿色荧光定位实验结果证实了Atp11定位于线粒体中;Western blotting检测结果显示atp11的缺失导致Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白的表达量显著降低。综上所述,粟酒裂殖酵母Atp11定位于线粒体且是线粒体呼吸链正常发挥功能所必须的。     

H1N1流感病毒血凝素对人肺细胞的损伤作用及机制研究

目的:研究H1N1流感病毒血凝素HA对人胚肺成纤维细胞的损伤作用并初步探讨其机理。方法:合成2009 H1N1的HA基因全长,分别将HA的PCR产物和pEGFP-N1质粒经Hind Ⅲ和EcoRI酶切电泳、纯化、连接并转化大肠杆菌DH5α,构建真核表达质粒pEGFP-N1/HA。质粒转染293细胞,检测其转染效率,并收获细胞总蛋白进行Western blotting检测。将阳性质粒转染MRC-5细胞,CCK-8检测HA的表达对细胞增殖活性,线粒体膜电位检测试剂盒检测其对细胞的早期凋亡的影响,ATP检测试剂盒检测HA的表达对ATP水平的改变。结果:PCR电泳检测获得分子量为1700 bp左右的目的条带,菌落PCR鉴定HA片段成功插入pEGFP-N1载体。荧光显微镜下检测pEGFP-N1/HA转染293细胞有明显荧光,Western blotting结果显示pEGFP-N1/HA转染细胞有单一的目的蛋白表达。HA的表达可明显抑制MRC-5细胞活力,HA的高表达降低MRC-5细胞的线粒体膜电位及ATP水平。结论:H1N1流感病毒HA对人肺细胞的损伤作用可能与影响肺细胞的线粒体功能有关。     

酶是怎样进入线粒体内定位的

线粒体是细胞质中的重要细胞器,包含有一整套三羧酸循环和氧化磷酸化的酶系,是细胞分解有机物质,产生能量载体——ATP的基地。有人也把它比喻为细胞的动力站,是生命活动不可缺少的组成部分。大家知道,酶的基本成分是蛋白质,线粒体内有这么多的酶系,其蛋白质少说也有几百种之多。这些蛋白质大都是在细胞质内合成     

缺氧肺动脉平滑肌细胞中线粒体ATP敏感钾通道开放对细胞色素C的分布及细胞增殖的作用

为了探讨线粒体ATP敏感钾通道（mitochondrial ATP-sensitive K^＋channel,mito KATP）和线粒体膜电位（△ψm）在细胞缺氧信号转导中的作用以及对缺氧肺动脉平滑肌细胞中细胞色素C在细胞内的分布及细胞增殖的影响,本实验将人肺动脉平滑肌细胞进行常氧或24h缺氧培养,并将标本分为六组：（1）对照组;（2）mito KATP,开放剂diazoxide组;（3）mito KATP阻断剂5-HD组;（4）24h缺氧组;（5）24h缺氧＋diazoxide组;（6）24h缺氧＋5-HD组。利用激光共聚焦显微镜成像法检测△、ψm;线粒体／胞浆成分分离试剂盒（Bio Vision）分离线粒体和胞浆成分后,Western blot检测两者细胞色素C;Western blot检测细胞中caspase-9的蛋白表达量;MTT法及PI染色后流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果显示：（1）diazoxide作用24h后,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P〈0．05;而5-HD作用24h与正常对照组比较,上述指标无明显变化（P〉0．05）。（2）缺氧24h组,结果与diazoxide组相似,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P〈0．05;24h缺氧＋diazoxide组与缺氧组相比较,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少（P〈0．05）;而24h缺氧＋5-HD组与缺氧组比较,R-123荧光明显降低,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显升高,caspase-9的蛋白表达显著增加,细胞增殖明显减少、凋亡增多（P〈0．05）。上述实验结果提示,缺氧可以引起mito KATP,的开放以及△ψm的去极化,并进而抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆,抑制线粒体凋亡途径,从而参与并影响肺动脉高压的发生、发展。     

NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的结构和功能研究进展

NAD^ —依赖型异柠檬酸脱氢酶是一个核编码线粒体酶,参与三羧酸循环,负责催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸,是循环路径中的限速酶。目前在酶学性质、亚基组成、基因克隆、蛋白组装与转运,以及功能等方面开展了许多研究。本文就这些方面的新进展进行综述。     

家蚕V型ATP酶B亚基的克隆及表达特征

V型ATP酶(Vacuolar-type ATPase)是一种定位于细胞膜和细胞器膜上的氢离子转运酶。它利用ATP水解的能量将氢离子转运到液泡、囊泡或者胞外,从而维持细胞内正常的酸碱环境。V型ATP酶B亚基(V-ATPase B)作为ATP的催化位点,也有着非常重要的作用。为了探讨家蚕V-ATPase B(Bm V-ATPase B)的功能,首先从家蚕五龄幼虫的中肠c DNA中克隆了Bm V-ATPase B基因并构建原核表达载体进行原核表达,获得了重组蛋白,经质谱鉴定正确后,通过镍柱亲和层析的方法纯化了该蛋白并制备了多克隆抗体;最后分析了该蛋白在家蚕丝腺中的表达特征并利用免疫荧光对其在丝腺中的表达位置进行了定位。结果显示Bm V-ATPase B基因序列全长1 473 bp,预测蛋白分子量55 k Da,预测等电点5.3。通过Western blotting对家蚕5龄第3天和上蔟第1天幼虫丝腺的不同区段进行Bm V-ATPase B蛋白的表达特征分析,发现在两个时期该蛋白均在前部丝腺高量表达,而在中部丝腺和后部丝腺表达量相对较低。进一步对两个时期丝腺的不同区段进行免疫荧光定位,发现该蛋白在两个时期的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺均定位于细胞层。利用激光共聚焦显微镜对该蛋白进行进一步的定位,发现该蛋白主要在丝腺的细胞膜表达。研究结果明确了该蛋白在丝腺中的表达模式,为深入研究该蛋白在蚕丝纤维形成中的作用奠定了基础。     

低浓度哇巴因对人白血病细胞株Jurkat 的生长调控作用及其分子 机制初步研究

目的:观察低浓度哇巴因对人白血病细胞株Jurkat生长的影响并初步探讨哇巴因特异性调节Jurkat细胞生长的机制。方法:分别用不同低浓度哇巴因作用于人白血病细胞株Jurkat后,采用四甲基偶氮唑盐MTT法检测细胞增殖情况、流式细胞学FCM技术检测细胞凋亡情况以及细胞内线粒体膜电位变化情况,Western blot法观察哇巴因对Jutkat细胞膜表面钠钾ATP酶的表达调节作用。结果:MTT及FCM检测结果表明随着哇巴因浓度的增高,哇巴因对Jurkat细胞的增殖抑制及促凋亡作用越明显。WesternBlot结果显示30nM及50nM哇巴因作用于Jurkat细胞株48h后引起细胞钠钾ATP酶表达下调,[3H]-哇巴因结合实验结果显示在Jurkat细胞株随着哇巴因作用浓度升高,细胞膜钠泵对哇巴因的亲和力逐渐下降。结论:低浓度哇巴因即可抑制白血病细胞株Jurkat增殖并诱导其凋亡。这种特异性细胞生长调控作用与哇巴因引起的细胞膜钠钾ATP酶表达变化相关,最终引起细胞内线粒体膜电位发生变化,释放相关凋亡蛋白,诱导细胞凋亡。     

MFRN1过表达对293T细胞生长及线粒体功能的影响

Mitoferrin-1(MFRN1)是溶质携带蛋白家族的一员,是线粒体内膜上最主要的铁运输蛋白。为了观察MFRN1过表达对293T细胞生长及线粒体功能的影响,采用包装慢病毒和感染293T细胞的方法构建MFRN1稳定过表达的细胞模型(293T-MFRN1),并对其线粒体功能进行评价。构建的稳定细胞株293T-MFRN1中MFRN1转录水平及蛋白表达水平显著增加(P0.01),MFRN1过表达细胞线粒体内总铁的含量明显增加(P0.05);电镜显示线粒体结构损伤,线粒体嵴减少、空泡化;线粒体能量代谢受抑制,细胞ATP含量显著下降,腺苷酸池总量(ATP+ADP+AMP)比对照组减少约40%;细胞生长受到抑制,在细胞培养48 h后高表达组细胞数量显著低于对照组;细胞内羟自由基(·OH)含量增加;线粒体DNA发生明显的氧化损伤。以上表明,MFRN1表达量的稳定对细胞功能极为重要,表达量异常增加将导致细胞线粒体功能障碍、细胞增殖抑制。     

寒冷诱导产热时大鼠棕色脂肪能量代谢相关蛋白谱的变化

棕色脂肪组织(BAT)的生理作用与白色脂肪显著不同,它以产热的形式释放能量而不是将能量以ATP的形式储存．线粒体是在能量代谢和维持细胞稳态中具有重要功能的细胞器．为了更好地了解棕色脂肪中的能量代谢过程,运用双向电泳及质谱相结合的技术,分离了大鼠白色和棕色脂肪线粒体,对其差异蛋白质谱进行了系统分析和鉴定．参与脂肪和氨基酸代谢、三羧酸循环及线粒体呼吸链的蛋白质在棕色脂肪线粒体中的表达明显高于白色脂肪线粒体,在寒冷诱导下这些蛋白质的表达进一步上调．此外,参与辅酶Q合成的一系列COQ 基因在棕色脂肪中经寒冷适应后表达明显上调．该研究表明,辅 酶Q合成的增高在非颤栗性产热中具有重要作用,为进一步了解棕色脂肪特异性的能量代谢提供了新的思路．     

鱼腥藻PCC7120中琥珀酸半醛脱氢酶的初步表征及结构分析

蓝藻琥珀酸半醛脱氢酶催化琥珀酸半醛到琥珀酸的转化,使得蓝藻的三羧酸循环变得完整。BLAST序列分析预测鱼腥藻PCC7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。为了证实all3556基因编码蛋白的催化功能,构建了p ET28a-all3556表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中进行重组蛋白诱导表达;利用镍亲和层析方法对all3556蛋白进行了分离纯化。酶动力学测试表明all3556蛋白是一个NADP+-依赖型的琥珀酸半醛脱氢酶。生物信息学分析发现all3556蛋白和其他来源的琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列具有一定的同源性,在催化中心的氨基酸残基高度保守。     

鼻咽癌下调新基因NOR1相互作用蛋白的筛选和鉴定

NOR1基因是新的鼻咽癌相关基因,该基因在鼻咽癌细胞系HNE1和鼻咽癌组织中表达下调．在鼻咽癌细胞HNE1中恢复NOR1基因表达抑制了鼻咽癌细胞的生长和增殖能力．为了探讨NOR1基因的生物学功能,以NOR1基因为诱饵运用酵母双杂交技术在人胎脑文库中筛选其交互作用蛋白,挑选阳性克隆,进行DNA序列分析和同源检索,阳性克隆编码7个不同的蛋白质,其中一个阳性克隆编码线粒体ATP合成酶亚基OSCP蛋白．瞬时转染pCMV-myc-NOR1质粒进入鼻咽癌5-8F细胞,通过密度梯度离心法分离线粒体蛋白,Western blot检测表明myc-NOR1蛋白分布于线粒体与胞浆．免疫荧光检测表明在鼻咽正常上皮细胞NP69中内源性NOR1蛋白与线粒体存在明显共定位．随后采用特异性酵母双杂交、免疫荧光共定位、免疫共沉淀技术证实了NOR1与OSCP在线粒体内存在交互作用．提示,NOR1是一个新的线粒体蛋白,可能通过结合OSCP蛋白调控细胞能量代谢,为深入探讨其功能提供了重要线索．     

酵母线粒体ATP合酶生物合成及组装机制研究进展

线粒体ATP合酶是线粒体氧化磷酸化的关键酶,其功能缺陷会导致能量代谢障碍相关的线粒体疾病。线粒体ATP合酶是由多个亚基组成的蛋白复合物,其生物合成和组装是个复杂的生物过程。酵母是研究线粒体ATP合酶结构、生物合成和组装机制的模式实验材料之一,且相关研究取得了很多进展。本文概述了国内外用酿酒酵母研究线粒体ATP合酶的结构、调控线粒体ATP合酶亚基生物合成和组装的辅助蛋白及合酶的模块化组装过程的研究进展,以期为线粒体ATP合酶的工作机制及相关线粒体疾病的研究提供理论借鉴和参考依据。     

慢病毒介导shRNA特异性干扰MRPL18基因对胰岛素瘤细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体核糖体蛋白大亚基18(mitochondrial ribosomal proteins L18,MRPL18)基因低表达对小鼠胰岛素瘤细胞(MIN6)线粒体能量代谢的影响,该研究利用慢病毒介导的MRPL18 shRNA特异性干扰MRPL18基因,构建MRPL18基因低表达的MIN6细胞模型。Real-time PCR和Western blot检测干扰前后MRPL18 mRNA和蛋白质的表达情况。流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化。海马生物能量代谢仪检测细胞线粒体功能。高效液相色谱检测细胞ATP、ADP和AMP含量。结果显示:转染MRPL18-shRNA后,MRPL18 mRNA和蛋白质表达均显著降低(P0.05、P0.01),细胞ROS明显升高(P0.05);细胞氧耗率、基础呼吸、最大呼吸和储备呼吸能力显著降低,同时ATP产量和质子漏也减少(P0.05、P0.01)。细胞ATP含量和能荷较对照组减少,ADP和AMP含量显著增加(P0.05、P0.01)。证实了MRPL18基因表达下调后细胞内发生了代谢障碍。推测MRPL18是影响线粒体功能的关键蛋白质,该蛋白在细胞代谢过程中发挥着重要作用。MRPL18表达下降所建立的线粒体功能障碍的MIN6细胞模型,可用于线粒体糖尿病发病分子机制的研究。     

ATP依赖的人Lon蛋白酶的表达、纯化及其活性鉴定

ATP依赖的人Lon蛋白酶是一种同质寡聚、环状的蛋白酶,主要位于细胞线粒体基质中。许多研究表明,Lon蛋白酶对于维护细胞的内环境稳定起着重要作用,并参与线粒体蛋白质量控制和代谢调控。将pPROEX1 His6-Lon重组质粒在Escherichia coli Rosetta 2菌株中诱导表达用Ni2＋柱亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白。经纯化后,Lon蛋白酶的比酶活达到0.17 U/mg。通过多肽底物Rhodamine 110、bis-（CBZ-L-alanyl-L-alanine amide）[（Z-AA）2 Rh110]的降解检测显示,Lon蛋白酶具有肽酶活性,并被ATP所刺激。Casein和线粒体转录因子A降解实验表明,纯化的Lon蛋白酶具有蛋白水解活性,而且蛋白水解活性依赖于ATP。     

朊病毒对中枢神经系统的影响及其作用机制

本文着重叙述了以几个问题：（１）朊病毒能否从牛转移感染到人;（２）朊病毒的感感染途径是怎样的;（３）朊病毒感染有何条件;（４）正常的朊病毒蛋白在神经元和胶质细胞表面表达有何重要功能;（５）朊病毒蛋白功能的结构基因;（６）朊病毒的可能作用机制。最后,分析了朊病毒影响中枢神经系统的两条可能途径,即破坏正常朊病毒蛋白的功能和与小神经胶质细胞共同作用提高神经元对自由基的敏感性及增加氧化自由基的含量。     

Mfn-2降低促进培养的大鼠血管平滑肌线粒体自噬

目的研究线粒体融合蛋白基因2(Mfn-2)降低表达对培养的大鼠血管平滑肌细胞(rVSMCs)中线粒体自噬的影响。方法将rVSMCs采用无血清培养基同步化48h后,分别感染腺病毒载体Adv-Mfn-2-SiRNA和空载Adv-Lac-Z作为实验组和对照组,实验分为三部分,其中第一部分提取细胞总蛋白后进行Western Blot分析Mfn-2的表达,第二部分JC-1处理后运用流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,第三部分通过透射电子显微镜显示线粒体超微结构的改变以及自噬体的形成和积累过程。结果 Adv-Mfn-2-SiRNA以感染复数60pfu/细胞感染同步化后的rVSMCs 24h后,Western Blot分析表明,Mfn-2的表达与对照组相比明显降低(P0.05);流式细胞术检测结果显示实验组较对照组线粒体膜电位明显下降(P0.05);透射电子显微镜显示实验组线粒体减少,而自噬体明显增多。结论 Mfn-2降低可导致培养的大鼠血管平滑肌线粒体自噬大量增加