粟酒裂殖酵母中Mef2在线粒体中功能的研究

由核编码基因控制的线粒体翻译对线粒体中电子传递链复合物的合成是必不可少的。旨在揭示粟酒裂殖酵母中Mef2蛋白的主要功能。利用同源重组的方法构建Δmef2突变体,观察Δmef2在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基的生长表型;生物信息学分析结果显示Mef2的N端含有一段由31个氨基酸组成的线粒体定位序列(MTS),为进一步确定Mef2蛋白的定位,在Mef2的C端添加一个GFP荧光标记,观察GFP绿色荧光的位置。接着采用Northern blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码m RNAs的影响。最后,运用Western blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码的蛋白的影响。研究结果表明,Δmef2菌株在非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷型菌;GFP绿色荧光定位实验证实了Mef2定位于线粒体中;Northern blotting实验结果显示mef2的缺失不影响线粒体基因组编码m RNAs的转录;Western blotting检测结果显示mef2的缺失导致Cox1、Cox3、Atp6和Cob1蛋白的表达量降低。综上所述,Mef2是一个与线粒体功能密切相关的蛋白,并且参与了线粒体编码蛋白Cox1、Cox3、Atp6和Cob1的翻译。     

粟酒裂殖酵母蛋白Atp4定位和功能的研究

研究粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中Atp4的定位和参与线粒体功能的机制。借助于基因敲除、荧光显微镜观察、线粒体提取、生化试剂处理和Western blotting等技术开展研究。在甘油培养基上,Δatp4突变菌株表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;Fluorescence microscope观察到用GFP标记的Atp4和线粒体是共定位的;采用生化试剂TritonX-100和蛋白酶K处理以及碳酸钠处理Atp4-Flag和yHL6381线粒体,结果表明Atp4定位在线粒体内膜;Western blotting实验结果表明Atp4缺失导致Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达量剧烈下降,Cox3和Cox4蛋白表达量也有略微下降。综上所述,Atp4在线粒体内膜发挥功能,对于维持线粒体编码蛋白的正常表达至关重要,是线粒体呼吸链功能的发挥所必需的。     

粟酒裂殖酵母中Shy1定位及功能的研究

旨在揭示芽殖酵母线粒体蛋白SHY1(YGR112W)在粟酒裂殖酵母中同源蛋白Shy1的功能。借助基因敲除方法获得shy1基因缺失菌株获Δshy1,并观察其在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基上的生长表型;生物信息学分析显示粟酒裂殖酵母Shy1在N端含有大概30个氨基酸的线粒体定位序列(MTS),为进一步确定Shy1蛋白的定位,借助nmt1启动子调控下的Shy1蛋白C端GFP荧光标记,观察GFP绿色荧光位置。最后利用Western blotting检测shy1的缺失对线粒体蛋白的影响。研究结果表明,shy1基因缺失菌株在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷型菌株;当GFP标记于nmt1启动子调控下的Shy1蛋白C端时,绿色荧光观察确定Shy1蛋白定位在线粒体;Western blotting检测结果显示shy1缺失导致线粒体相关蛋白的表达量明显下降;结果表明,粟酒裂殖酵母Shy1定位于线粒体且是线粒体呼吸链正常发挥功能所必须的。     

粟酒裂殖酵母中指示线粒体形态的荧光标签的构建

粟酒裂殖酵母是优秀的研究线粒体模型机理的模式生物.为建立适合粟酒裂殖酵母的指示线粒体形态的荧光标签,本研究以pYJ19质粒为骨架,构建了由粟酒裂殖酵母nmt41启动子控制的、以增强型绿色荧光EGFP为报告基因、以粟酒裂殖酵母自身蛋白Cox4为线粒体定位序列(Mitochondrial targeting sequences)来源的mts和以leu1营养为选择标记的质粒系统pMTS7.将pMTS7转化粟酒裂殖酵母yHL6381,以Mito-Tracker线粒体染料为对照,荧光显微镜观察结果发现,pMTS7能够与MitoTracker共定位,能正确显示线粒体定位.与具有一定毒性且染色结果不易控制的MitoTracker相比,利用pMTS7标记线粒体可以在显微镜下长时间观察清晰的线粒体形态,而且可以看到线粒体分裂融合的动态变化.pMTS7的成功构建为研究粟酒裂殖酵母中线粒体相关基因的突变体提供了技术工具.     

粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起细胞絮凝的机制研究

粟酒裂殖酵母中PPR蛋白在线粒体和叶绿体的RNA代谢中起重要作用,ppr基因的缺失会引起线粒体功能异常(ppr5除外)。旨在揭示粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起细胞絮凝的机制。利用含有半乳糖的培养基分别培养WT、Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10,观察野生型和突变体的生长表型;通过添加不同的金属离子及改变细胞表面pH来探究诱导这类突变体出现絮凝的因素;采用RT-PCR技术检测缺陷菌中编码细胞表面絮凝因子及细胞壁重构酶基因的表达情况。研究结果表明:ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的敲除会引起由Ca²⁺依赖型半乳糖结合蛋白参与的细胞絮凝;不同的pH和不同金属离子对这些缺陷菌的细胞絮凝有影响;ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失会使细胞内编码絮凝因子和细胞壁重构酶基因表达上调。线粒体功能异常会诱导絮凝基因表达上调和细胞壁属性发生改变,从而产生絮凝现象。     

粟酒裂殖酵母Sls1在线粒体中的功能研究

线粒体是真核生物中非常重要的细胞器之一,它参与ATP的合成以及物质代谢、细胞凋亡等多种生理过程。在研究线粒体功能时,粟酒裂殖酵母是一种很好的模式生物。在本文中,我们研究了与线粒体相关的蛋白Sls1的功能。在非发酵型培养基上,Δsls1突变菌株的生长出现缺陷。Western-Blot实验表明,在Δsls1菌株中,线粒体编码蛋白的水平也出现了剧烈的降低。敲除sls1影响了线粒体编码蛋白Cox1的合成。我们的研究表明Sls1是一个与线粒体功能密切相关的蛋白,它的其中一个功能是维持了线粒体编码蛋白的正常水平,并且参与了线粒体编码蛋白Cox1的合成。     

绿色荧光蛋白及其应用

绿色荧光蛋白是在水母中发现的新型报告分子,能在多种生物体内表达并发出荧光。对GFP中一些特定氨基酸进行突变可以产生多种类型的突变体,有利于研究蛋白之间或细胞器之间的相互作用。目前,GFP已经用于基因表达的报告、细胞动态的研究、活细胞内蛋白的定位及westernbloting检测中。GFP美好的应用前景也促进了有关GFP的研究,特别是寻找新的突变体并将之运用到细胞生物学和分子生物学的各个领域。     

巴斯德毕赤酵母甘油转运体的发现及功能研究

目的:分离确认巴斯德毕赤酵母中甘油转运体并初步研究其功能。方法:通过生物信息学方法从NCBI数据库中查找可能的甘油转运体(gt1,GeneID:8197545),并通过DAS软件对其跨膜结构域进行预测。通过PCR方法扩增该基因并将其与EGFP融合克隆到pPICZ B及pRS424载体进行亚细胞定位;同时将其与pRS424载体连接后电转到粟酒裂殖酵母中进行异源表达确定其功能;通过同源重组敲除gt1基因并在不同培养基中培养测定aox1基因表达量。结果:生物信息学显示与酿酒酵母中已经证明的甘油转运体(sugar transporter 1,stl1)类似,GT1蛋白同样为具有疏水结构域的跨膜蛋白,同时亚细胞定位结果显示GT1蛋白定位于细胞膜上,包含有gt1基因的粟酒裂殖酵母可以在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长而野生型不可以;在Δgt1突变体中aox1基因可以获得组成型表达。结论:分离并确认了巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体GT1,并初步证明其与aox1基因甘油阻遏相关。     

粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL21表达不足引发细胞粘附

【目的】随机选择裂殖酵母核糖体蛋白RPL21作为研究对象,分析其表达不足对细胞的影响。【方法】通过同源臂交换的方法,敲除裂殖酵母基因组中RPL21蛋白的编码基因rpl21-1和rpl21-2,观察突变菌株rpl21-1Δ和rpl21-2Δ细胞内的核糖体合成情况以及细胞表型变化。【结果】突变菌株rpl21-1Δ和rpl21-2Δ细胞内总的rpl21(rpl21-1+rpl21-2)表达水平与野生型菌株相比分别减少了66.5%和58.7%,合成的核糖体总量较野生型菌株分别下降了62.8%和50.4%。突变菌株在YEPD液体培养基中培养时发生细胞粘附现象,而基因回补的重组菌株rpl21-1Δ/RPL21-1和rpl21-2Δ/RPL21-2突变株细胞中粘附现象消失。【结论】核糖体蛋白损伤造成核糖体合成受阻,进而引发细胞生长过程中的粘附在粟酒裂殖酵母中是普遍存在的现象。     

人SDCT2蛋白亚细胞定位信号分析

为了确定人高亲和力钠离子依赖性二羧酸共转运蛋白（high-affinity sodium-dependent dicarboxylate co-transporter, SDCT2,NaDC3）在细胞内的定位,构建了SDCT2与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白表达载体,并转染肾小管上皮细胞LLC-PK1,激光共聚焦显微镜观察显示,SDCT2蛋白主要定位于细胞的基底侧膜上.同时将SDCT2-EGFP融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达,可见融合蛋白的绿色荧光仅分布在细胞膜上.为了进一步确定该蛋白质的亚细胞定位信号序列,将SDCT2基因的N端及C端分别缺失,并构建缺失突变体与EGFP的融合蛋白表达载体,将它们转染到LLC-PK1中,观察SDCT2 缺失体在细胞内的分布情况.结果显示,N端缺失的SDCT2蛋白主要位于细胞质中,顶膜和基底侧膜上也有表达;C端缺失的SDCT2蛋白主要位于基底侧膜上,顶膜几乎没有表达,细胞质中表达很少.免疫组化结果也显示,SDCT2只表达于人近端肾小管上皮细胞的基底侧膜.这表明SDCT2蛋白的N端序列对其亚细胞定位是必需的,人SDCT2蛋白的基底膜定位信号位于N端序列中.     

伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析

以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187到第241个氨基酸残基之间.上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础.     

伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析

以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187到第241个氨基酸残基之间。上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础。     

盘基网柄菌DJ-1蛋白的亚细胞定位研究

DJ-1基因的突变或缺失导致帕金森病相关症状,但其在帕金森病中的作用以及其亚细胞位置尚存在争议。盘基网柄菌是研究神经退化性疾病的模式生物,通过绿色荧光蛋白(GFP)标记DJ-1蛋白,利用荧光蛋白技术及DJ-1与GFP共定位技术在正常和氧化情况下研究其在盘基网柄菌的亚细胞定位,可以为探索DJ-1蛋白亚细胞位置与致病机制之间的联系奠定基础。研究结果表明,正常情况下盘基网柄菌DJ-1蛋白位于细胞质内,一旦受到氧化应激, DJ-1蛋白则转移至线粒体,这个亚细胞位置转移与DJ-1蛋白C117位点的氧化相关。该研究为探索DJ-1蛋白如何在氧化应激条件下完成对细胞的保护提供了实验依据。     

小鼠不同组织的差异线粒体蛋白质组研究

线粒体是真核细胞的重要细胞器, 它不仅具有合成ATP等普遍性功能, 也具备一定的组织特异性, 适应不同组织的生理功能需要. 为了鉴定组织相关性线粒体蛋白, 系统地分析和比较了C57BL/6J小鼠肝脏、肾脏和心脏线粒体蛋白质组. 通过双向凝胶电泳和MALDI-TOF/TOF质谱, 在这3种小鼠组织中共发现了87种组织特异的线粒体差异蛋白; 采用ICPL的定量蛋白质组方法和Western blotting技术, 进一步证实某些典型的组织特异性蛋白. 还通过实时定量PCR和Western blotting技术分析了6种具有代表性的组织差异线粒体蛋白质在线粒体内外的分布, 并结合激光共定位技术观察它们在相应组织活细胞内的表达与定位. 研究发现, 这些核基因编码的线粒体蛋白确有组织特异性分布和线粒体内外丰度差异特性. 本结果为组织特异性线粒体蛋白质的深入研究奠定了实验基础.     

基于冰核蛋白的乳酸菌表面展示系统的构建

[目的]验证来源于丁香假单胞菌的冰核蛋白在乳酸乳球菌表面展示外源蛋白的可能性.[方法]以绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)基因gfp为报告基因,以冰核蛋白基因的N末端和NC端作为展示单元,构建乳酸菌表面展示载体pHZ101和pHZ102,并转化大肠杆菌(Escherichia coli JM109和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363.[结果]荧光显微镜观察显示重组大肠杆菌和乳酸乳球菌均能检测到绿色荧光.Western blot结果表明GFP蛋白在重组大肠杆菌和乳酸乳球菌中均得到表达,并且INPN-GFP蛋白多数滞留于乳酸乳球菌细胞质内,而INPNC-GFP蛋白则大部分定位于乳酸乳球菌的细胞膜上.[结论]以上结果表明丁香假单胞菌的冰核蛋白能引导外源蛋白定位于乳酸乳球菌的细胞膜上,为乳酸菌表面展示系统的构建提供了新的方向.     

Pmr1基因缺失对粟酒裂殖酵母细胞有性生殖和有丝分裂的影响及其分子机制研究*

目的:pmr1基因编码P型钙转运ATP酶Pmr1,参与维持细胞壁完整性和调控胞质分裂。以粟酒裂殖酵母为模式细胞,探究pmr1缺失后对细胞有性生殖及细胞分裂中肌动蛋白环精细动力学的影响,揭示pmr1缺失后细胞异常生长过程中的关键基因和代谢通路。方法:通过细胞生长速率测定、产孢统计、绿色荧光蛋白标记肌动蛋白和活细胞成像的方法,检测pmr1缺失对细胞有丝分裂和有性生殖的影响;采用RNA-Seq对野生型菌株和pmr1Δ菌株测序和生物信息学分析,并进行qRT-PCR验证。结果:pmr1缺失后细胞生长减慢,分裂期细胞长度减小,子囊孢子长度增加,且肌动蛋白环的形成时间增加。RNA测序结果显示,mfm1、mfm2和mat1-Mc下调,错配修复通路cdc1和exo1上调以及糖酵解/糖异生途径pgi1、pfk1和dld1下调是引起pmr1Δ孢子长度增加的主要因素;糖酵解/糖异生途径tdh1、pgk1下调,以及脂肪酸合成代谢途径fas1、fas2、cut6和lcf1下调导致了pmr1Δ分裂期细胞长度减小;hsp9上调是影响pmr1Δ收缩环形成时间增加的关键基因。qRT-PCR实验证实,pmr1缺失后关键基因的表达趋势与RNA-Seq结果一致。结论:pmr1缺失后,粟酒裂殖酵母细胞中错配修复通路、糖酵解/糖异生途径及脂肪酸合成代谢途径发生障碍,导致细胞及孢子形态均异常,且肌动蛋白环形成受阻,细胞增殖减缓。     

稻瘟病菌中甘油激酶基因在碳源代谢途径中的功能分析

作为引起水稻病害的主要病菌之一,稻瘟病菌是一种重要的模式生物,对于研究植物与病原菌之间的互作起着极其重要的作用。甘油激酶在体内可以催化甘油转化为甘油3-磷酸,对甘油的分解代谢起着重要的作用。在稻瘟病菌基因组中有两个编码甘油激酶的基因,分别为Mogly1和Mogly2。我们通过体内同源重组的基因敲除技术,获得两个基因的基因缺失突变体ΔMogly1和ΔMogly2,以及两个基因的双敲突变体ΔMogly1ΔMogly2。表型分析发现这些突变体在生长,产孢,致病性等方面相对于野生型均没有明显变化,但是ΔMogly1和ΔMogly1ΔMogly2在完全培养基上面的气生菌丝减少,菌落颜色变白。通过测量这些突变体在不同碳源培养基上的生长,发现ΔMogly1和ΔMogly1ΔMogly2在以山梨醇、葡萄糖、甘油和蔗糖为唯一碳源的培养基上生长速率均减慢。而在以甘油为唯一碳源的培养基上生长速度被抑制的最为显著。这说明Mogly1和Mogly2在碳源代谢中的作用是不同的,Mogly1基因可能在碳源代谢中扮演着重要的角色,而Mogly2可能是功能冗余的基因。     

携带小鼠白介素-4截短型突变体基因的5型腺相关病毒载体的构建及外源蛋白的体外表达

目的:制备携带碳端结构域缺失的小鼠白介素-4(Interleukin-4,IL-4)基因突变体的5型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, r AAV)并在细胞水平检测其介导的外源蛋白表达情况。方法:通过分子克隆技术构建携带小鼠IL-4碳端22个氨基酸缺失的突变体的表达质粒pSNAV-mIL-4ΔC22,三质粒共转染法制备重组的5型AAV病毒,体外感染人支气管上皮样细胞系16HBE和BEAS-2B,并通过Western blot和ELISA检测外源蛋白表达。结果:DNA测序表明构建的小鼠IL-4碳端第118位氨基酸位点处截短的突变体基因表达序列正确无误,制备的重组病毒载体r AAV5-mIL-4ΔC22滴度约为3×10~(11)vg/m L。r AAV5-GFP感染16HBE和BEAS-2B细胞后36小时开始可见持续稳定的荧光蛋白表达,重组病毒r AAV5-mIL-4ΔC22感染16HBE和BEAS-2B细胞后外源蛋白在培养上清中呈分泌型表达。结论:本研究成功构建了携带小鼠IL-4碳端结构域缺失型突变体的AAV表达质粒并制备了重组病毒r AAV5-mIL-4ΔC22,该病毒可有效转染16HBE和BEAS-2B细胞并介导外源基因分泌表达截短型小鼠IL-4突变体蛋白。     

MitoQ对高糖诱导的心肌细胞线粒体功能影响

目的:探讨MitoQ对高糖诱导的心肌细胞线粒体功能影响。方法:常规获取与纯化SD大鼠新生仔鼠心肌细胞,分为对照组、高糖组、实验组。对照组用含10%血清的DMEM培养基(5.5 mmol/L葡萄糖)培养;高糖组用含血清的高糖DMEM培养基(33mmol/L葡萄糖)培养;实验组用含血清的高糖DMEM培养基(33 mmol/L葡萄糖)和MitoQ。MTT法检测心肌细胞存活率,氯离子荧光探针检测细胞内氯离子浓度,流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡率,超氧化物阴离子荧光染色检测心肌细胞活性氧(reactive oxygen,ROS)含量,利用ATP检测试剂盒检测心肌细胞中的ATP水平,Western blot法检测心肌细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)蛋白水平。结果:与对照组相比,高糖组的心肌细胞增凋亡率、ROS产生、氯离子相对浓度均明显增加,ATP显著降低(P0.05),细胞内caspase-3蛋白表达显著上升(P0.05);与高糖组相比,实验组凋亡率降低,ROS产生、细胞内caspase-3蛋白表达均显著降低(P0.05)。结论:高糖会引起心肌细胞线粒体障碍,造成心肌细胞凋亡,MitoQ可降低细胞内ROS和caspase-3水平,抑制心肌细胞凋亡,改善心肌细胞线粒体功能。     

缺失dbpA导致大肠杆菌DNA复制起始延迟

探讨核糖体成熟因子dbpA对大肠杆菌DNA复制起始的影响。观察ΔdbpA基因缺失突变体的DNA复制式样、细胞倍增时间、细胞体积等表型变化,并使用温度敏感性试验和蛋白定量实验探究dbpA的作用机理。结果发现与野生型BW25113相比,ΔdbpA突变体出现DNA复制的起始延迟,细胞倍增时间延长,细胞体积减小等表型变化,且在LB培养基比在ABTGcasa培养基中的变化更明显。温度敏感性实验显示DbpA与DnaA、DnaB或DnaC蛋白没有相互作用。蛋白定量实验显示ΔdbpA的细胞内总蛋白和DnaA蛋白含量都减少,且在LB培养基比ABTGcasa培养基中的减少程度更大。因此缺失dbpA导致大肠杆菌DNA复制起始延迟,原因可能是dbpA通过影响细菌内核糖体的组装或翻译过程影响蛋白质的合成,使细胞内总蛋白和DnaA蛋白的含量减少。这为明确dbpA的功能提供参考。