快速STR分型在法医DNA分析中的应用研究进展

STR分型是目前世界通用的DNA指纹分析方法.传统的分型方法包括DNA提取、DNA定量、PCR扩增和对扩增后的STR片段进行检测和分析,耗时较长(8¹0 h).一些情况下很难满足案件的实际需求.法医学家们在加快STR分型的方法研究一直不懈努力.现从快速提取DNA、无提取直接PCR、快速PCR、微流控芯片技术在STR快速分型方面的应用四方面,对近年来出现的可进行快速STR分型的新技术、新方法进行综述.     

多重PCR对真菌性角膜炎主要致病菌的菌属鉴定

目的:建立多重PCR体系对真菌性角膜炎主要致病真菌进行快速诊断并同时进行菌属鉴定的方法。方法:建立两个多重PCR体系(体系1和体系2),对真菌性角膜炎九种主要致病真菌DNA进行检测,观察该体系对真菌临床菌株、人类基因组及其他眼部常见致病微生物DNA的检测结果。结果:体系1对镰孢菌属扩增均产生约360bp的特异产物,对曲霉菌属、牵连青霉菌和新月弯孢菌扩增均产生约470bp的特异产物。体系2对镰孢菌属、曲霉菌属均无特异产物,而对牵连青霉菌产生了360bp的特异产物,对新月弯孢霉产生了300bp的特异产物。根据DNA模板在两个多重PCR体系中扩增出的不同特异条带可将九种真菌分为四个菌属。57株真菌临床菌株中55株的鉴定结果与常规鉴定结果一致。两体系对人类基因组及其他眼部常见致病微生物DNA的扩增结果均为阴性。结论:通过两个多重PCR体系检测可将真菌性角膜炎在菌属水平进行诊断及鉴定。该方法具有快速、简便、特异、灵敏的特点,具有较好的临床应用前景。     

一种简便、快速从病毒感染鱼、虾组织中制备PCR模板的方法

以虹彩病毒(iridovirus)感染大黄鱼的脾组织、对虾白斑杆状病毒(whitespotsyndromebaculovirus,WSBV)感染中国对虾的肌肉组织为材料,采用一种简便、快速的方法获得了可满足病毒PCR检测的高质量模板DNA,分别以针对虹彩病毒、WSBV的特异性引物进行PCR扩增,均能有效扩增出预期的条带。与常规DNA病毒模板制备方法相比,具有简便、快速、提取率高、无污染等优点,尤其适用于水产动物病毒PCR检测试剂盒的商品化开发及生产实际应用。     

通用PCR反向斑点杂交快速检测及鉴定致病性酵母菌

建立PCR结合寡核苷酸探针反向斑点杂交技术,快速检测及鉴定致病性酵母菌.将待检酵母菌种特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上,然后用生物素标记的真菌通用引物扩增的各真菌DNA片段,与固定在膜上的探针杂交.结果表明所用的真菌通用引物可扩增临床常见的真菌DNA,9种特异性探针具有高度的特异性.该方法检测35例临床分离菌株,结果与常规鉴定方法一致.该技术检测时间短、操作简单、不需要特殊设备,能部分满足临床检测的通量要求.具有很好的临床应用前景.     

一种快速制备丝状真菌PCR反应模板的方法

为建立一种快速、简便制备丝状真菌PCR反应模板的方法,提高丝状真菌菌株鉴定与转化子筛选效率,本试验以10种不同种丝状真菌为材料,比较了3种不同试剂微波法制备丝状真菌PCR反应模板的效果,并优化了微波处理的时间。试验结果表明,取少量菌丝,加入50mmol/L NaOH,无菌吸头将菌丝打散,微波炉高火处理30s,离心取上清,即可获得用作PCR反应的模板。该方法制备的10种不同种丝状真菌PCR反应模板用ITS引物进行扩增,都可得到与传统CTAB法提取的DNA模板同样清晰明亮的扩增条带。该法制备的PCR模板可用于不同引物和不同公司的PCR反应产品扩增。将该方法制备的PCR模板用于囊状匍柄霉Stemphyliumvesicarium转化子的筛选,其结果与传统CTAB法提取的DNA结果一致。此法为丝状真菌提供了更加快速简便的PCR模板制备方法,极大减少了DNA提取的人力和物力成本。     

建立快速、特异检测ApoE4基因型方法

目的:建立快速、特异检测载脂蛋白E(ApoE)基因型的方法.方法:采用碱裂解法抽提漱口水来源的颊粘膜上皮细胞的基因组DNA;优化各种改善高GC含量的的添加剂种类和浓度,包括二甲亚枫、甘油、甲酰胺、甜菜硷等,PCR产物进行HhaI酶切并DNA垂直电泳从而分析个体的ApoE基因型.结果:漱口水来源的基因组DNA能替代外周血DNA进行PCR扩增.甜菜碱、甲酰胺、甘油等对于ApoE4基因的扩增效果并不明显,而5%DMSO能显著提高ApoE4基因的扩增效率,并显著提高PCR扩增的特异性.结论:无创的简单的ApoE4基因分型被建立,极大易化了对ApoE4相关疾病的分子流行病的研究,对于其它基因的基因型研究提供有益的线索.     

基于四引物扩增受阻突变体系PCR 的多重乳腺癌相关SNP 位点检测方法的建立

为提高单核苷酸多态性检测的通量, 引入多重嵌合引物PCR 和毛细管电泳对四引物扩增受阻突变体系PCR 进行改进. 针对乳腺癌位点rs4784227(C>T), rs1219648(G>A)和rs3803662(T>C)设计特异性嵌合引物, 经一次PCR扩增后, 通过毛细管电泳分析产物长度, 同时确定3 个位点的基因型. 70 份全血和口腔拭子样本, 电泳结果均与测序一致, 实现成功分型. 本方法仅需一次PCR 和一次毛细管电泳即可获得3 个位点的分型结果, 操作简单、快速准确.     

应用xMAP液态芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的：建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法：根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果：xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论：xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

应用xMAP液念芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

PCR技术在检测鼠金黄色葡萄球菌中的应用研究

目的　建立实验大小鼠金黄色葡萄球菌的快速检测方法———PCR法。方法　根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果　金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性 ,结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。结论　本研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测。