环六亚甲基双乙酰胺对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化及PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化

用HMBA作为诱导分化剂.研究了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化效应,并采用免疫荧光技术观察了PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化.细胞经5mmol/L HMBA处理后,细胞形态产生明显变化.细长突起明显增加,生长速度减慢,倍增时间延长.24小时,48小时,72小时的生长抑制率分别为20%.40.6%.54.8%.细胞在软琼脂上生长不成集落.细胞周期时相的分布发生变化、G_0+G_1期比对照组增加18.4%.而s期细胞比对照组减少14.8%.细胞内cAMP、DG水平也发生了显著变化.HMBA处理24小时后.细胞内cAMP水平上升62%.DG水平下降64.7.处理48小时后.cAMP水平上升76.2%.而DG水平下降的69.8%.以上结果充分表明了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化作用.实验中还发现细胞经HMBA处理后.PKC-α分布于胞质,而PKA-RⅡ向胞核移位.提示HMBA对细胞的诱导分化作用与信号传递通路密切相关.     

两种第二信使系统在人胃癌MGc80-3细胞增殖分化调节中的相互关系

两种第二信使系统的正负调控作用的假说与细胞增殖失控的癌变机理之间关系,日益引起人们的注意。为此本工作利用HMBA 诱导分化剂和信使通路的阻断剂研究了两种第二信使系统(DG-PKC,cAMP-PKA)在人胃癌MGc80-3细胞生长分化调控过程中的相互关系。人胃癌MGc 80-3细胞在诱导分化剂处理24 h 后,其DG 水平与PKC 活性分别下降了64.7%和28.7%,而cAMP 及其结合蛋白的含量分别上升了62%和32.6%(48 h 后结果更为显著)。PKA-RⅡ表达增强,并从胞质移向核内分布。当用PKC 抑制剂H_7取代HMBA,阻断PKC 通路,24 h 后,DG 水平及PKC 活性均下降,而cAMP 含量上升了1.04倍。反之在HMBA 诱导分化的同时加入PKA 抑制剂使其cAMP 通路受到阻断后,cAMP 及其结合蛋白含量下降。而DG 含量与PKC 活性均上升到与对照组水平相似。PKA-RⅡ又仅仅在胞质中出现。以上实验充分显示了cAMP-PKA 与DG-PKC 两种信使系统在细胞增殖分化中的正负调控作用占有重要地位。     

在人胃癌MGC80-3细胞中PKA-RⅡ和PKC-α两套信使激酶系统亚类对c-myc和c-H-ras表达的共调作用关系

在前一实验基础上,我们进一步研究了人胃癌细胞系(MGC 80-3)的PKA-RⅡ和PKC-α对癌基因的共调作用。MGC 80-3细胞在HMBA诱导分化过程中c-myc和c-H-ras的表达抑制时,PKA-RⅡ的表达从胞质转向核内,而PKC-α则从核内转向胞质表达。当HMBA诱导细胞分化的同时,加入PKA抑制剂阻断cAMP-PKA通路,此时PKA-RⅡ仍在胞质表达,而PKC-α的表达又移位入核,c-myc和c-H—ras则重新表达。这显示了癌基因表达变化的调节和激酶亚类核移位的信息传递密切相关,它表现出两套信号系统对癌基因表达的共调作用。     

丁酸钠对人胃癌和食道癌细胞的生物学效应

5mM丁酸钠可使人胃癌MGc803细胞形态发生改变,细胞变长,出现胞浆突起,趋向于成纤维细胞形态的变化,使食道癌ECa109细胞的核/质比下降。同时能抑制细胞增殖,使细胞生长率下降,丁酸钠对细胞增殖的抑制作用是随其浓度的增加而增强的,具有剂量依赖关系。丁酸钠可促进人胃癌MGc803细胞胞质中微管和食道癌ECa109细胞内中等纤维的组装,这种变化对丁酸钠处理后细胞形态的改变有关。丁酸钠可使细胞阻断于G_1期。??对3’,5’-cAMP—PDE(cAMP-磷酸二酯酶)活力具有强的抑制作用,并提高细胞内cAMP水平,从而抑制细胞增殖。这些结果表明丁酸钠对人胃癌MGc803和食道癌ECa109细胞具有一定的诱导分化作用。     

B7-2胚胎性癌细胞与其分化细胞的周期特性

本文用~3H-thymidine标记B7-2EC细胞及其经HMBA诱导的分化细胞。根据连续标记和脉冲标记核百分率,计算和分析这两种细胞的细胞周期各时相特点。结果表明,未分化EC细胞的周期是18小时,其中G_1期1.7小时,S期13.6小时;分化细胞的周期是30小时,G_1期8.6小时,S期17.1小时。因此,B7-2分化细胞与未分化的相比,主要是G_1期和S期时相相应拉长。     

环六亚甲基双乙酰胺对胃癌不同细胞周期两条信号系统的调节

环六亚甲基双乙酰胺(HMBA)对MGc80-3不同时相细胞内cAMP-PKA与DAG-PKC两大系统不仅具有正负调控作用,而且其作用具有周期特异性. 其中G1期是最敏感的调控时相,与对照组相比,cAMP水平上升102.3%,PKA活性升高348%,DAG含量下降51.4%,PKC活性降低32.3%;次敏感时相为G2期;M期基本没受影响;S期变化规律不同于其他时相.     

HMBA诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中prohibitin的表达与定位变化

本文以HMBA诱导处理前后的人成骨肉瘤MG-63细胞为对象,对prohibitin在核基质中存在、分布及其与相关基因产物在HMBA处理前后MG-63细胞中的共定位关系进行观察研究.蛋白印迹杂交结果确证prohibitin存在于人成骨肉瘤MG-63细胞核基质蛋白组分中,并在HMBA处理后细胞核基质中表达下调,免疫荧光显微镜观察显示prohibitin定位在核基质上,经HMBA处理后出现分布位置与表达水平的变化.激光共聚焦显微镜观察可见prohibitin与MG-63细胞中c-fos、c-myc、p53和rb基因产物均存在共定位关系,但在HMBA处理后细胞中其共定位分布区域出现变化.研究结果证实prohibitin是一种核基质蛋白,定位于核基质上,prohibitin在人成骨肉瘤MG-63细胞诱导分化过程中的表达分布及其与相关癌基因、抑癌基因产物的共定位现象值得进一步探索和研究.     

HMBA诱导人肝癌SMMC-7721 细胞分化过程中 Nucleophosmin 的表达与定位变化

通过选择性抽提经环六亚甲基双乙酰胺（hexamethylene bisacetamide,HMBA）诱导处理前后的人肝癌SMMC-7721细胞核基质,并运用亚细胞蛋白质组学等分析技术,研究nucleophosmin (NPM)在核基质上的表达和定位变化,及其与相关基因产物的共定位关系,观察研究了nucleophosmin 在诱导分化前后人肝癌SMMC-7721细胞核基质中的存在、分布及其与相关基因产物的共定位关系.双向凝胶电泳和质谱鉴定结果显示,nucleophosmin 存在于 SMMC-7721 细胞核基质蛋白组分中,在 HMBA 处理后细胞核基质中表达下调.蛋白质印迹杂交实验结果确证了 nucleophosmin 在核基质中的存在及其在诱导处理后细胞核基质中表达下调的变化.免疫荧光显微镜观察显示,nucleophosmin 定位在 SMMC-7721细胞核基质上,经 HMBA处理后出现分布位置与表达水平的变化.激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示,SMMC-7721细胞中,nucleophosmin与 c-fos、c-myc、rb、p53 等基因产物具有共定位关系,但在诱导处理后细胞内的共定位区域发生了改变.研究结果证实,nucleophosmin 是一种核基质蛋白,定位于核基质纤维上,nucleophosmin 在人肝癌 SMMC-7721 细胞诱导分化过程中的表达分布,及其与相关癌基因、抑癌基因产物的关系对 SMMC-7721 细胞分化具有重要影响.     

小鼠Friend细胞诱导分化过程中c-myc和P~(53)基因表达与终端分化

本文观察了DMF,DMSO和HMBA对小鼠Friend细胞(MELC)诱导分化及TPA抑制分化过程中c-myc和P~(53)基因表达与终端分化的关系。MELC被5 mmol/L HMBA诱导分化后分别在1小时和4小时P~(53)与c-myc表达急剧下降,诱导2天,5天联苯胺阳性率和β-珠蛋白基因表达明显升高,c-myc和p~(53)基因表达仍维持在很低水平,同时G_1期细胞百分数增加。低浓度TPA明显抑制HMBA诱导分化效应,β-珠蛋白基因表达被抑制,但c-myc和P~(53)基因表达仍处于低水平,看来与增殖有关的c-myc和P~(53)表达之降低并不能直接导致分化基因的表达。     

HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化的观察

本文研究HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的诱导分化作用.细胞生长曲线测定和细胞分裂指数观察显示HMBA可明显抑制细胞增殖,细胞生长抑制率达64.14%,分裂指数抑制率为53.88%.光镜和透射电镜观察可见HMBA能诱导人肝癌SMMG-7721细胞形态和超微结构发生恢复性改变.生化检测或免疫细胞化学方法观察显示,HM-BA处理后细胞γ.谷氨酸转肽酶(γ-GT)活性和甲胎蛋白(AFP)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达均降低,而酪氨酸.酮戊二酸转氨酶(TAT)活性增强.流式细胞仪分析表明HMBA引起细胞发生G0/G1期阻滞.以上结果表明HMBA能有效抑制人肝癌细胞恶性增殖活性,逆转肝癌细胞恶性形态与超微结构特征,改变肝癌细胞相关酶活性和抗原表达,引发G0/G1期阻滞,从而对肝癌细胞具有明显的诱导分化作用.     

小鼠胚胎癌细胞来源的分化细胞合成IGF-Ⅱ

胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)是一种促有丝分裂多肽,对哺乳类胚胎生长和发育起着重要作用。然而,在早期胚胎发育阶段,有关这种生长因子的产生、功能及其对胚胎细胞生长、分化的调节作用所知甚少。本文用纯化大鼠8.5 KDa增殖刺激活性因子(multiplicationstimulating activity,MSA)作免疫原,制备了多克隆抗体。以同位素在体外代谢标记PC 13小鼠多能胚胎癌(EC)细胞及其经维生素A酸(RA)诱导分化的内胚层样END细胞,在分化的PC 13 END细胞培液中检测到与IGF-Ⅱ抗体起免疫沉淀的物质,而未分化的PC 13 EC细胞并不分泌这种物质,证明了从EC细胞来源的分化细胞能合成和分泌IGF-Ⅱ蛋白。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,这种免疫沉淀物质为分子量35 KDa和14-15 KDa的三种形式蛋白。35 KDa分子可能是一种IGF_Ⅱ前体蛋白或具IGF-Ⅱ专一性的载体蛋白。用免疫酶染色方法,在另一株多能B 7-2 EC克隆细胞中,同样证明经环六亚甲基双乙酰胺(HMBA)诱导分化的内胚层样细胞的胞质中染有与IGF-Ⅱ抗体起反应的物质;而且在HMBA诱导处理24小时即已出现这种染色反应。随着药物处理时间延长,除了细胞形态进一步呈梭形和细胞质突起更显著外,免疫反应强度未见有明显变化,表明IGF-Ⅱ的合成在EC细胞诱导分化的较早阶段就开始。根据这些结果,推测早期胚胎发育中内胚层细胞可能产生和分泌IGF-Ⅱ蛋白。     

钙调素抑制剂——三氟拉嗪对肿瘤细胞增殖和微管组装的影响

本文用钙调素抑制剂——三氟拉嗪处理人胃癌MGC-803细胞,用免疫荧光细胞化学方法,放射免疫法和速流荧光分析等方法研究了钙调素对细胞增殖,环核苷酸代谢及微管组装,有丝分裂等细胞功能的调节作用。实验结果表明,TFP明显地抑制了人胃癌细胞的增殖,这种抑制增殖的作用,具有剂量和时间依赖关系,细胞群体中G_1期细胞增多,S期细胞下降,DNA合成明显地受到抑制。TFP处理的胃癌细胞仅在短时间内(5'-30')cAMP含量升高,cGMP浓度降低,cAMP/ ??cGMP比值比对照组高4.4倍,但此后环核苷酸含量又很快恢复到对照组水平。本实验还观察到TFP处理后的MGC-803细胞胞质铺展,细胞形态的改变与胞质微管的分布有密切联系,实验结果表明TFP加强了人胃癌细胞MTOC对微管的组装能力,使微管分布得到恢复,微管纤维呈放射状延伸到细胞边缘,充满胞浆,使细胞呈现出展平的多边形,趋向于正常上皮细胞形态的变化,本实验结果表明TFP抑制癌细胞增殖及使微管组装加强可能是通过对CaM活性的抑制作用。此结果有助于说明转化细胞内钙调素的变化,可能是与转化细胞增殖失控和胞质微管消退有关。     

PKCα 由线粒体向细胞核转运与胃癌细胞凋亡诱导密切相关

PKC在细胞生长、分化、凋亡和信号转导调节中具有重要作用.通过激光扫描共聚焦显微镜证实:在胃癌BGC-823细胞中,一部分PKCα 定位于线粒体,一部分定位在胞浆,细胞经TPA处理后,位于线粒体和胞浆的PKCα 向细胞核转运;Western blot检测则发现PKCα 蛋白表达水平在TPA处理前后没有发生变化.此外,应用凋亡诱导剂和特异性PKC抑制剂的实验结果进一步证实:胃癌细胞内PKCα由线粒体和胞浆向细胞核转运与细胞凋亡的诱导密切相关.提示PKCα在细胞内的定向转运可能是与细胞凋亡过程相关联的重要事件之一.     

佛波酯PMA促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)释放及机理研究

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一个强促有丝分裂因子和促新血管生成因子,在实体瘤的发生及转移过程中起重要作用。由于bFGF缺乏信号肽序列,人们至今无法阐明bFGF释放的详细机制。我们选用PMA处理人鼻咽癌细胞CNE-2,发现胞内bFGF表达量提高,48 h后,bFGF胞外释放量有明显增加,提示PKC可能直接参与对bFGF释放的调控作用。同时我们的结果也表明:CNE-2细胞中PMA激活的PKC-α可在体外条件下磷酸化细胞内源的bFGF(18KDa)。结果提示了CNE-2细胞内PKC-α转位激活可能磷酸化胞内bFGF底物,导致bFGF释放的增加。     

环六亚甲基双乙酰胺体外诱导胚胎性癌B7—2细胞分化对MS_3基因表达的影响

MS_3 cDNA是多潜能胚胎性癌细胞专一的顺序,HMBA可诱导B 7—2细胞分化为原始内胚层样细胞。用定量细胞质RNA点印迹杂交法分析了MS_3基因在小鼠胚胎性癌B 7—2细胞经HMBA诱导前和诱导后的表达水平。小鼠成纤维细胞NIH3T3被用作阴性对照,MS_3基因的表达水平在B 7—2细胞经HMBA诱导5天后下降了86％。鉴于HMBA对B 7—2细胞的诱导效率约为90％,这一实验结果表明在HMBA诱导分化中,MS_3基因的表达被抑制。     

小鼠艾氏腹水癌细胞内3'''',5''''-环腺苷酸(cAMP)的免疫荧光细胞化学定位和外源性cAMP对癌细胞内cAMP的影响

本工作用显示cAMP的免疫荧光细胞化学方法观察了小鼠艾氏腹水癌细胞内cAMP的分布,并发现经外源性cAMP及氨茶碱处理后,有使小鼠艾氏腹水癌细胞内cAMP荧光增强的效应。cAMP主要分布在胞质内。实验组动物从接种癌细胞的次日起,每日从腹腔注射2毫克的cAMP和1毫克的氨茶碱,发现在接种后第9天,大多数癌细胞胞质内的cAMP荧光增强,以核周区胞质内的荧光最显著。进一步证实了我室以前用生化测定癌细胞内cAMP含量的结果。本文并对显示cAMP的免疫荧光细胞化学方法进行了讨论,用cAMP荧光染色反应的特异性鉴定证明了方法的可靠性。     

高尔基体在人胃腺癌细胞诱导分化过程中的变化

MGc 80-3细胞高尔基体呈发育差、结构不典型状态,但经dBcAMP诱导后,细胞内高尔基体组数增多、分布集中、体积增大,高尔基囊数目增多、排列规则,囊的膜内颗粒增多、分布较为均匀,恢复为与其相应正常细胞相似、发育良好的典型高尔基体结构。这种变化不仅抑制了胃癌细胞的恶性分泌活动,同时对细胞表面成份的变化也起着一定的调节作用。认为高尔基体结构与功能向典型方向的转??变是癌细胞恶性表型逆转的一种重要表现,对于癌细胞由恶性向正常方向的分化具有重要影响。     

视黄酸对胃癌细胞周期的调控

视黄酸(RA)能够抑制许多类型癌细胞生长、诱导细胞凋亡和调节细胞周期。本文研究了全反式视黄酸(ATRA)对人胃癌细胞的作用机理。结果表明,ATRA通过诱导细胞滞留在G_0/G_1期而显著抑制胃癌细胞生长,但ATRA不能诱导胃癌细胞凋亡;ATRA调控细胞周期与c-myc、磷酸化Rb水平的下调和p21~(WAF1/CIP1)、p53水平的上调有关,而cyclinD_1和CDK_4水平没有明显变化。在RA抗性细胞中,ATRA不能调节这些基因表达。结果证实,ATRA对胃癌细胞生长抑制与其诱导细胞滞留在G_0/G_1期有关,而与细胞凋亡的诱导无关,许多重要的、与周期相关的分子,包括cmyc、p21~(WAF1/CIP1、p53和Rb等参与细胞周期的调控。     

内源性活性氧水平及锰型超氧化物歧化酶的表达与胃癌细胞分化、增殖相关

检测了不同分化的胃癌细胞株内MnSOD基因的表达及胞内活性氧限（ROS)的水平。同时通过基因转染观察上调或下调MnSOD基因表达对SGC790l胃癌细胞胞内ROS水平及增殖能力的影响。用电穿孔法将人反义和正义MnSOD cDNA真核表达载体pHβA—SOD(-)／pHβA—SOD（ )转入790l细胞,用含G418的RPMIl640培养基筛选稳定表达克隆。然后用RT-PCR鉴定MnDSOD基因的表达。同时用RT-PCR方法检测正常胃粘膜组织及MKN-28、SGC790l、BGC823、HGC-27四株高、中、低、未分化胃癌细胞株内的MnSoD的mRNA表达。利用DCFH-DA荧光染色方法检测不同分化胃癌细胞株及790l转染细胞株内的ROS水平。四唑蓝比色法(MTT)绘制MKN-28、SGC790l、BGC823、HGC-27四株不同分化胃癌细胞及正义、反义、空载MnSOD转染790l细胞的生长曲线。发现不同分化胃癌细胞内的MnSOD普遍呈低表达且与分化程度平行,不同分化胃癌细胞株胞内ROS水平随着MnSOD表达的下调逐步上升,细胞增殖加快。较之MnSOD空载790l,正义、反义MnSOD转染的790l细胞中该基因的表达出现明显上调及下调,胞内ROS水平较对照细胞也相应有显著降低和升高。正义株增殖受抑,反义株增殖加快。表明胃癌细胞内MnSOD的表达与肿瘤的分化程度呈负相关。可通过改变胞内RoS水平改变MnSOD基因的表达,从而调节胃癌细胞的生长。     

人甲状腺髓样癌TT细胞胃动素基因表达的调控

目的:研究人甲状腺髓样癌TT细胞系中胃动素基因表达调控.方法:通过人甲状腺髓样癌TT细胞体外培养,观察经cAMP,生长激素或甲状腺雌激素诱导后,胃动素表达的改变以及胃动素对TT细胞生长、侵袭和转移的影响.结果:甲状腺髓样癌TT细胞表达胃动素mRNA,胃动素可抑制TT细胞的生长.当胃动素基因沉默后,TT细胞转移和侵袭能力增加.当TT细胞分别经cAMP、胃动素、生长激素或甲状腺刺激素孵育48小时后,胃动素基因转录增加,降钙素基因相关肽与胃动素mRNA比值持续下降.环磷酸腺苷可降低TT细胞增殖和c-myc基因的表达.结论:人甲状腺髓样癌细胞生长活性可能与甲状腺C细胞(低的降钙素基因相关肽与胃动素比率)分化的表型有关.