3',5'-cAMP对艾氏腹水癌细胞膜功能的作用(cAMP的转运和膜蛋白分子的侧向运动)

本工作用外源性cAMP加氨茶碱处理艾氏腹水癌小鼠,于不同瘤龄期观察到癌细胞膜对cAMP的转运功能和膜内蛋白质分子侧向扩散运动的变化、以及膜内可动性蛋白质分子的百分比的改变。这些表型变化均在接种后5—7天最为显著。接种后第7天,实验组癌细胞膜对cAMP的转运加强,而膜内蛋白质分子侧向扩散运动??减慢,抑制率达72.8%,二者P值均小于0.01。而接种后第9天,实验组与对照组之间二者变化均无统计学差异。这些变化表现了癌细胞膜的功能状态的变化。进一步阐明了我们过去工作——3’,5’-cAMP对体内艾氏腹水癌细胞作用机理,接种后第9天癌细胞内cAMP水平升高不是外源性cAMP的积累,而是内源性的代谢结果;阐明了接种后第5天cAMP-PDE活性下降的动因。同时我们也进一步看到膜功能、膜结构和胞质内cAMP水平及其二酯酶活性等变化的动力学关系,以及它们和癌细胞增殖抑制之间的相互关系。从而说明这些变化在癌细胞“逆转”中的意义与其内在联系。     

用免疫荧光技术研究细胞周期中核基质的分布变化

本文利用含有抗核基质自发抗体的硬皮人血清,以小鼠艾氏腹水癌细胞为材料,用间接免疫荧光染色的方法,追踪了对应核基质抗原在细胞周期中分布的变化。结果显示,在末期和间期之间存在一个核基质抗原从细胞质向细胞核内转移的过程。由于这一过程是通过核膜进行的,从而提示核基质结构可能有解聚和再聚合的行为。用酶化学结合间接免疫荧光染色的方法,初步研究了抗原的化学性质。染色形态的比较研究显示所用血清中可能含有不同于以前发现的、抗新的核基质抗原的自发抗体。     

癌基因表达与膜分子侧向运动和cAMP转运的相关性(环核苷酸对癌细胞作用)

Ehrlich癌细胞在cAMP诱导下,于接种后5-7天癌基因c-myc、c-fos、c-H-ras、c-sis的表达强烈被抑制.与此同时癌细胞膜对cAMP转运增强.膜蛋白分子扩散系数[D]值下降,均以接种后7天最为显著P<0.01.可动分子百分比提高.这反映出癌细胞的分化变异.但至接种后9天,上述癌基因重新表达,膜蛋白分子扩散系数上升,cAMP转运下降,这可能是导致接种后11天癌细胞增殖急剧上升,细胞内cAMP水平下降的原因.说明Ehrlich细胞在去恶化及恶化过程中,癌基因表达变异.膜蛋白分子运动和癌细胞多种表型之间密切相关.     

癌基因表达与膜分子侧向运动和cAMP转运的相关性(环核苷酸对癌细胞作用)

Ehrlich癌细胞在cAMP诱导下,于接种后5-7天癌基因c-myc、c-fos、c-H-ras、c-sis的表达强烈被抑制.与此同时癌细胞膜对cAMP转运增强.膜蛋白分子扩散系数[D]值下降,均以接种后7天最为显著P<0.01.可动分子百分比提高.这反映出癌细胞的分化变异.但至接种后9天,上述癌基因重新表达,膜蛋白分子扩散系数上升,cAMP转运下降,这可能是导致接种后11天癌细胞增殖急剧上升,细胞内cAMP水平下降的原因.说明Ehrlich细胞在去恶化及恶化过程中,癌基因表达变异.膜蛋白分子运动和癌细胞多种表型之间密切相关.     

钙调素抑制剂——三氟拉嗪对肿瘤细胞增殖和微管组装的影响

本文用钙调素抑制剂——三氟拉嗪处理人胃癌MGC-803细胞,用免疫荧光细胞化学方法,放射免疫法和速流荧光分析等方法研究了钙调素对细胞增殖,环核苷酸代谢及微管组装,有丝分裂等细胞功能的调节作用。实验结果表明,TFP明显地抑制了人胃癌细胞的增殖,这种抑制增殖的作用,具有剂量和时间依赖关系,细胞群体中G_1期细胞增多,S期细胞下降,DNA合成明显地受到抑制。TFP处理的胃癌细胞仅在短时间内(5'-30')cAMP含量升高,cGMP浓度降低,cAMP/ ??cGMP比值比对照组高4.4倍,但此后环核苷酸含量又很快恢复到对照组水平。本实验还观察到TFP处理后的MGC-803细胞胞质铺展,细胞形态的改变与胞质微管的分布有密切联系,实验结果表明TFP加强了人胃癌细胞MTOC对微管的组装能力,使微管分布得到恢复,微管纤维呈放射状延伸到细胞边缘,充满胞浆,使细胞呈现出展平的多边形,趋向于正常上皮细胞形态的变化,本实验结果表明TFP抑制癌细胞增殖及使微管组装加强可能是通过对CaM活性的抑制作用。此结果有助于说明转化细胞内钙调素的变化,可能是与转化细胞增殖失控和胞质微管消退有关。     

增强UV-B辐射对小麦根尖细胞游离钙离子分布的影响

以小麦根尖为材料,利用低温装载法在根尖细胞中成功地装载了酯化形式的钙离子荧光指示剂fluo-3/AM,利用激光共聚焦显微技术检测了增强UV-B辐射后小麦根尖细胞内游离钙离子荧光强度的分布,并对胞质内游离钙离子浓度进行了测定.结果表明:(1)对照组小麦根尖细胞内钙离子荧光主要分布于细胞胞质周缘;而经UV-B辐射处理后,细胞内钙离子荧光不仅分布在胞质周缘,且在细胞壁与胞间隙可观察到大量钙离子荧光.(2)对单个细胞内钙离子荧光强度进行测定,发现UV-B处理使细胞胞质内游离钙离子浓度明显升高.     

培养的正常细胞和肿瘤细胞内微管变化的研究——Ⅱ.肿瘤细胞内微管的免疫荧光细胞化学观察

本实验用管蛋白抗体间接免疫荧光细胞化学方法,观察了我国建株的人胃低分化粘液腺癌MGc 80-3,人胃腺癌SGC-7901,人鼻咽癌上皮样细胞CNE,人食管癌上皮细胞ECa-109,人肺鳞癌LTEP-78,人啼腺癌LTEP-a_1,人肺小细胞癌LTEP-p七株癌细胞和HeLa细胞,小鼠S_(180)-V肉瘤细胞的微管形态。与人的正常包皮成纤维细胞和食管上皮细胞内精细的CMTC结构对比,肿瘤细胞间期的胞质微管普遍有减少或缺如的现象。参考Brin-kley对微管免疫荧光染色图形的分型方法,我们将观察的各种微管染色图形归纳为四种类型,比较各种细胞群体内微管类型的分布。肿瘤细胞群体内多数为微管缺如型和稀疏型,未见典型的丰满型,而正常细胞群体内都是丰满型。同时,肿瘤细胞的MTOC区面积明显增大。分裂期的肿瘤细胞内,有丝分裂器纺锤体微管荧光形态与正常细胞的没有差别。本文对肿瘤细胞间期胞质微管减少和缺如以及MTOC区明显增大的现象及其可能的意义进行了讨论,认为这是癌变机制研究中值得深入探讨的重要课题之一。     

生物膜表面介电常数的荧光测量

利用正交试验的方法,得到了荧光探针Dansyl Phosphatidyl-ethanolamine(DPE)标记艾氏腹水癌细胞质膜表面的最佳条件,首次建立了用DPE测定生物膜表面介电常数的方法.并用比方法测定了艾氏腹水癌细胞质膜表面介电常数,观察了有关的物理、化学因素对这种荧光测量方法的可能影响.     

HeLa、HEK293、SH-SY5Y细胞中的Tau蛋白

通过间接免疫荧光测定了HeLa、HEK-293、SH-SY5Y细胞内Tau蛋白的分布,观察到在细胞间期单克隆抗体Tau-1的荧光信号分布于细胞质和胞核中．特别是HeLa细胞,其胞核内具有相对较高的Tau蛋白免疫荧光信号．通过分离SH-SY5Y的细胞核,更为清楚地显示了Tau蛋白在细胞核中的分布,并且免疫荧光信号与DNA的Hoechst33258染色信号相重合．Western blotting的测定结果进一步证明了SH-SY5Y细胞的胞质和胞核中均含有Tau蛋白的不同异构体．以上结果提示,Tau蛋白不仅存在于神经、肌肉等细胞内,也存在于肿瘤细胞系,并且分布于间期的胞核中．     

精氨酸对艾氏腹水癌细胞体外作用的机制探讨

本研究采用小鼠艾氏腹水癌细胞探讨了精氨酸对一些肿瘤细胞体外作用的可能机制。结果表明精氨酸对艾氏腹水癌细胞体外蛋白质合成有显著的抑制作用,其作用受培养介质中一些氨基酸的影响;细胞内游离氨基酸浓度分析结果提示精氨酸的作用可能并不是通过干扰细胞内游离氨基酸池所引起,其具体作用机制尚待进一步实验的揭示。     

用~（31）P磁共振谱对艾氏腹水癌和肉瘤S－180细胞代谢的研究

艾氏腹水癌细胞和肉瘤Ｓ－１８０细胞是抗肿瘤药物筛选常用细胞株．实验采用取自小鼠腹腔的第７～８天的艾氏腹水癌和Ｓ－１８０细胞,用３１Ｐ磁共振谱测得了细胞内小分子含磷代谢成分;计算了细胞内ｐＨ值;还用３１Ｐ谱探讨了作用机制不同的三种抗代谢物：碘乙酸、２,４－二硝基苯酚及棉酚对艾氏腹水癌细胞代谢的影响     

血清抑癌多肽作用机制的初步探讨——对癌细胞膜及其骨架的影响

本文研究血清抑癌多肽(SCSP)对癌细胞表面的效应和其表面蛋白质分子的侧向扩散及其内的F-actin的变化.扫描电镜观察结果是SCSP作用后,艾氏腹水癌细胞表面的微绒毛变为平坦而光滑的结构.从荧光漂白恢复技术测得的结果是上述癌细胞表面蛋白质分子的侧向扩散系数(?)降低.用Rhodamine—Pha-lloidin标记上述癌细胞得知其内的F—actin增加.从上述结果推测,在SCSP杀伤艾氏腹水癌细胞过程中,使F—actin在癌细胞内重组,有更多的F—actin与癌细胞质膜内大分子紧密相连,使癌细胞表面分子的活动性降低,故在癌细胞表面的结构变平,其蛋白质分子的扩散受限制而变慢.     

精氨酸加压素、神经降压素和强啡肽对神经母细胞瘤细胞cAMP和cGMP的影响

本文报道小鼠神经母细胞瘤细胞在无血清培养条件下,用cAMP和cGMP放射免疫测定方法,观察AVP、NT和DYN对小鼠神经母细胞瘤细胞内cAMP和cGMP水平及cAMP/cGMP比值的影响。结果发现:AVP使cAMP水平和cAMP/cGMP比值显著升高(P<0.01);DYN使cGMP水平升高(P<0.01),但cAMP/cGMP比值下降;NT使cAMP水平和cAMP/cGMP比值下降,同时又使cGMP水平升高。结果提示:这三种神经肽可以分别对神经母细胞瘤细胞内cAMP、cGMP水平和cAMP/cGMP比值产生影响。     

过氧化物酶蛋白1 真核表达载体构建及在Hela 细胞的表达与定位

目的:构建过氧化物酶蛋白1(PRDX 1)的真核表达载体,观察其在Hela细胞内表达及定位。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR方法扩增得到小鼠PRDX 1编码序列,酶切后克隆至pcDNA3-myc载体。重组质粒通过PCR、酶切、测序证明构建正确后经脂质体转染Hela细胞,然后利用Western blot和荧光显微镜技术观察该融合蛋白在细胞内表达及定位。结果:经鉴定证明重组质粒构建正确;Western blot实验显示,该质粒能够在Hela细胞中特异表达;免疫荧光试验显示,蛋白产物分布在胞浆和胞核,证明该蛋白在细胞内高表达。结论:成功构建带有myc标签的PRDX 1真核表达载体,该质粒能够在哺乳细胞中特异表达并且外源性PRDX 1蛋白分布在Hela细胞胞浆胞核内,为深入研究PRDX 1蛋白在细胞内相关生物学研究奠定了基础。     

大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)的甲胎蛋白合成与细胞周期时相的关系

大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)是一甲胎蛋白阳性的肝癌细胞系,适用为研究甲胎蛋白基因表达调控的体外模型。本文用免疫荧光法和免疫沉淀法在非同步的和同步的细胞样品中检测了甲胎蛋白在不同周期时相细胞内的合成情况。从免疫荧光反应结合~3H-TdR脉冲标记放射自显影和鉴别不同时相染色方法对比分析,说明该系肝癌细胞在晚G_1期荧光反应很弱,进入早S期胞质荧光明显增强,至晚S期胞质荧光又有减弱。免疫沉淀法检测同步的晚G_1、早S和晚S期细胞的结果,与细胞学所得结果一致。甲胎蛋白量是早S期高于晚S期,而S期又明显地高于晚G_1期。早S期是该系肝癌细胞合成甲胎蛋白的高峰时相。甲胎蛋白合成在不同时相细胞之间有明显差异,提示控制细胞周期进程有可能对甲胎蛋白基因的表达进行调控。     

环六亚甲基双乙酰胺对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化及PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化

用HMBA作为诱导分化剂.研究了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化效应,并采用免疫荧光技术观察了PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化.细胞经5mmol/L HMBA处理后,细胞形态产生明显变化.细长突起明显增加,生长速度减慢,倍增时间延长.24小时,48小时,72小时的生长抑制率分别为20%.40.6%.54.8%.细胞在软琼脂上生长不成集落.细胞周期时相的分布发生变化、G_0+G_1期比对照组增加18.4%.而s期细胞比对照组减少14.8%.细胞内cAMP、DG水平也发生了显著变化.HMBA处理24小时后.细胞内cAMP水平上升62%.DG水平下降64.7.处理48小时后.cAMP水平上升76.2%.而DG水平下降的69.8%.以上结果充分表明了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化作用.实验中还发现细胞经HMBA处理后.PKC-α分布于胞质,而PKA-RⅡ向胞核移位.提示HMBA对细胞的诱导分化作用与信号传递通路密切相关.     

环六亚甲基双乙酰胺对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化及PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化

用HMBA作为诱导分化剂.研究了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化效应,并采用免疫荧光技术观察了PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化.细胞经5mmol/L HMBA处理后,细胞形态产生明显变化.细长突起明显增加,生长速度减慢,倍增时间延长.24小时,48小时,72小时的生长抑制率分别为20%.40.6%.54.8%.细胞在软琼脂上生长不成集落.细胞周期时相的分布发生变化、G_0+G_1期比对照组增加18.4%.而s期细胞比对照组减少14.8%.细胞内cAMP、DG水平也发生了显著变化.HMBA处理24小时后.细胞内cAMP水平上升62%.DG水平下降64.7.处理48小时后.cAMP水平上升76.2%.而DG水平下降的69.8%.以上结果充分表明了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化作用.实验中还发现细胞经HMBA处理后.PKC-α分布于胞质,而PKA-RⅡ向胞核移位.提示HMBA对细胞的诱导分化作用与信号传递通路密切相关.     

cAMP与基因表达的调节

一般都认为cAMP在真核生物细胞的激素和基因表达调节物之间起胞内媒介的作用。但是,用cAMP指导的磷酸化作用难以解释特殊基因在真核细胞中表达的机理。     

小鼠BW5147细胞与网织红细胞融合后cAMP水平及其磷酸二酯酶的细胞化学观察

本实验用PEG介导,将小鼠BW_(5147)细胞与小鼠网织红细胞在体外进行悬浮融合,经HAT选择性培养基筛选获得的胞质杂交细胞,表现出增殖减慢、生长率下降、生瘤能力降低等去恶化现象。本实验从cAMP-PDE细胞化学反应显示出胞质杂交细胞内cAMP-PDE活性比亲本BW_(5147)瘤细胞有所减弱,而cAMP水平则有所升高,提示胞质杂交细胞恶性程度下降可能与细胞内cAMP-PDE活性降低和cAMP水平升高具有一定的关系。本实验的结果将为进一步探索促使肿瘤细胞逆转的可能途径提供一定的依据。     

基于CFTR的胞浆内第二信使cAMP检测方法的建立*

目的: 建立一种基于CFTR可敏感检测胞浆内第二信使cAMP的检测方法。方法: 构建CFTR和YFP-H148Q/I152L真核表达载体,应用脂质体转染法构建共表达CFTR和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞,倒置荧光显微镜观察其表达情况,流式细胞仪检测细胞纯度;荧光淬灭动力学实验验证细胞模型的有效性;荧光淬灭动力学实验验证细胞模型可筛选CFTR调节剂;放射免疫法检测加入CFTR激活剂后细胞内的cAMP浓度。结果: 倒置荧光显微镜下观察到CFTR表达在细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达于胞浆中;成功构建共表达CFTR和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型;荧光变化斜率值与CFTR调节剂浓度成剂量依赖关系,该模型可筛选CFTR调节剂;荧光变化斜率值可反映胞浆内cAMP浓度,该模型可敏感检测胞浆内cAMP浓度。结论: 此细胞模型可以高效敏感检测胞浆内第二信使cAMP浓度,为cAMP信号相关靶点的研究提供一种简便快捷的方法。