柚果实不同部位的柚皮苷含量分析

用HPLC方法测定柚果实中柚皮苷含量的结果表明:果皮中柚皮苷含量最高,占总含量的92%以上,果肉高于种子。果皮中柚皮苷合成和积累主要在膨大期之前,而果肉和种子中柚皮苷在幼果期至膨大期间大量积累。果实趋于成熟时,不同品种间柚皮苷含量变化趋势不同,贮藏期的柚皮苷含量减少。     

SPE-HPLC-DAD法同时检测柑橘药用资源中黄烷酮类和川陈皮素成分

为检测柑橘类5种药用资源中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、柚皮素和橙皮素等5个黄烷酮物质和川陈皮素的含量。实验用70%乙醇水溶液分别浸提化橘红、陈皮、青皮、橘络和橘核,提取液经稀释后利用C18固相萃取柱除杂和浓缩,再以0.5%醋酸水溶液和甲醇为流动相进行反相梯度洗脱,用串联二极管阵列检测器(DAD)扫描紫外光谱做定性分析,并分别在283、285、290、335nm波长处做定量检测。在该条件下6个类黄酮成分均实现基线分离;外标法定量,线性相关性好(R2≥0.9998);加标回收率为95.83%~103.56%,相对标准偏差为2.90%~8.78%。含量分析结果显示:芸香柚皮苷10.49mg/g、柚皮素0.327mg/g、橙皮素0.129mg/g在青皮中含量最高,橙皮苷10.78mg/g、川陈皮素1.74mg/g在陈皮中含量最高,柚皮苷19.20mg/g在化橘红中含量最高。该方法适用于柑橘药用资源中微量类黄酮成分的准确定性和定量检测。     

利用DNS法快速分析及优化柚皮苷的酶解过程

【目的】建立采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法快速测定柚皮苷水解率的方法,并利用该方法对柚苷酶催化水解柚皮苷生成柚皮素的反应过程进行优化研究。【方法】利用棘孢曲霉JMUdb058发酵得到的柚苷酶催化水解柚皮苷,采用DNS法对柚皮苷酶解过程中还原糖的生成量进行分析,经过换算得到柚皮苷的水解率,并在此基础上通过单因素实验优化柚皮苷的酶解过程。【结果】在柚皮苷的水解过程中,还原糖的生成量与柚皮苷的水解量及柚皮素的生成量均呈现出良好的线性关系,因此可利用DNS法测定体系中还原糖的生成量,并通过换算得到柚皮素的生成量。利用该方法优化柚皮苷的酶解过程得到柚苷酶转化柚皮苷的最适温度为50°C、pH为5.0、酶用量为8 U/mL、底物浓度为0.2 g/100 mL。在此条件下,柚皮苷酶解150 min后可达到平衡,此时其水解率为85%。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法测得Km为     

经典名方温胆汤物质基准总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量测定

目的：研究并建立紫外分光光度法（UV）和高效液相色谱法（HPLC）分别测定温胆汤物质基准中总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量。方法：以柚皮苷为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮的含量并采用HPLC法测定柚皮苷和新橙皮苷的含量。结果：采用直接测定法测定总黄酮类成分在284 nm处有较强吸收，柚皮苷在20.22～80.88μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，平均加样回收率为98.33%。柚皮苷和新橙皮苷分别在0.01～0.51 mg/mL和0.01～0.50 mg/mL范围内有良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性的RSD均小于5.0%，加样回收率分别为97.11%和102.72%；温胆汤物质基准中总黄酮的平均含量为15.03%，柚皮苷、新橙皮苷的平均含量分别为22.78 mg/g和9.75 mg/g。结论：建立的温胆汤物质基准总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量测定方法简单、稳定、重复性好，为温胆汤及其相关制剂进一步研究和开发提供实验基础。     

人肠道产柚苷酶菌株分离、鉴定及其对柚皮苷的转化特性

【目的】从健康人肠道微生物菌群中分离能将柚皮苷高效转化为柚皮素的特定细菌菌株,对分离得到的菌株进行菌种鉴定并研究菌株对柚皮苷转化特性,目的是为柚皮素的高效生物合成提供新细菌资源。【方法】取健康人新鲜粪样,在厌氧工作站内培养24 h后进行梯度稀释并涂板,从板上挑取单菌落与底物柚皮苷进行厌氧培养,用高效液相色谱检测底物被转化情况。根据16S rDNA序列及相关生理生化特性分析,对所分离的柚皮苷转化菌进行菌种鉴定,并测定转化菌株对底物柚皮苷的转化动态和转化能力。【结果】从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株,分别命名为AUH-JLD3、AUH-JLD7、AUHJLD104和AUH-JLD109。根据16S rDNA序列分析,结合形态学及相关生理生化特性等,将其分别鉴定为布劳特氏菌(Blautia sp.AUH-JLD3)、肠球菌(Enterococcus sp.AUH-JLD7)、拟杆菌(Bacteroides sp.AUHJLD104)和巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus subsp.AUH-JLD109)。转化动态研究结果表明,所分离的4株细菌菌株均能在12 h内将0.2 mmol/L底物柚皮苷转化为柚皮素;转化能力测定结果显示,菌株AUHJLD3、AUH-JLD7、AUH-JLD104及AUH-JLD109能够高效转化底物柚皮苷的最大浓度分别为0.2 mmol/L(平均转化率66.67%)、0.8 mmol/L(平均转化率86.49%)、0.2 mmol/L(平均转化率73.68%)以及1.6 mmol/L(平均转化率93.20%)。【结论】本研究首次从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株,其中巴氏链球菌AUH-JLD109对底物柚皮苷转化能力最强。     

沼泽红假单胞菌粗酶液生物转化柚皮苷

目的初步探索沼泽红假单胞菌粗酶液生物转化柚皮苷的特点。方法利用高效液相色谱技术,以柚皮苷的降解率为指标,考察不同温度、pH、底物浓度和培养时间对粗酶液降解柚皮苷的影响。在适宜转化条件下,探索底物和产物的含量变化。结果最适转化条件:40℃~50℃,pH 7.0~8.0,最大有效转化底物浓度750μg/mL,15 h时柚皮苷降解率较高为55.31%。在最适转化条件下,底物浓度500μg/mL,培养至17 h柚皮苷被降解完全,柚皮素浓度达到最大值204μg/mL,转化率为85.39%;10~19 h,转化率均大于80.00%,13 h达到最大值94.83%。结论本研究首次发现沼泽红假单胞菌粗酶液能够生物转化柚皮苷,并阐明了不同培养条件对柚皮苷降解的影响,以及转化过程中物质含量的变化。     

不同贮藏条件对沙田柚果实苦味物质含量的影响

沙田柚原产广西,营养丰富且适合高血压和糖尿病等患者食用,近年来在沙田柚产业中存在品质下降、有苦味、异味生成等问题。为了研究不同贮藏条件下沙田柚苦味物质的含量变化,该文利用高效液相色谱仪,对室温包薄膜袋(A)、室温不包薄膜袋(B)和4℃低温不包薄膜袋(C)三种不同贮藏条件下,沙田柚外果皮、中果皮、囊衣、汁胞和种子中柚皮苷、柠檬苦素和诺米林在贮藏过程中的含量变化进行了测定。结果表明：沙田柚果实苦味物质以柚皮苷为主,主要分布在中果皮和囊衣中,柠檬苦素主要分布在种子和外果皮中,诺米林主要分布在种子中。各处理果实在贮藏过程中苦味物质含量变化不同,其中柚皮苷含量略有上升,柠檬苦素和诺米林含量整体呈下降趋势,略有波动,而汁胞中柠檬苦素和诺米林含量先上升再下降。三种不同贮藏条件相比,4℃低温不包薄膜袋贮藏的果实汁胞中柚皮苷和柠檬苦素的含量最高,在贮藏第30天,A、B、C 三种不同贮藏条件果实汁胞中柚皮苷含量分别为(0.139±0.006)、(0.190±0.009)和(0.194±0.019) mg?g-1,柠檬苦素含量分别为(47.28±1.91)、(33.64±1.90)和(84.19±5.56)μg?g-1。与此相反,外果皮、中果皮、囊衣和种子中柚皮苷、柠檬苦素和诺米林含量最低。该研究结果为采后沙田柚贮藏保鲜方式的选择提供了理论指导。     

不同品种柑桔果实中柚皮苷的含量变化

不同品种柑桔果汁中苦味成分柚皮苷的浓度差异悬殊(在182～1050ppm之间),中果皮内柚皮苷浓度是果汁的26～40多倍,外果皮、内果皮和种子等组织中柚皮苷浓度亦远高于果汁。果实生长过程中,果汁和果皮内柚皮苷浓度呈下降趋势。果汁中所含柚皮苷可应用国产吸附树脂将其脱除。     

Screening and identification of a fungal strain affecting hydroxylation of naringin

柚皮苷是中草药枳实、橘红的主要有效成分,用于心血管疾病的防治.为了开发生物法生产柚皮苷的羟基化衍生物,从土壤中分离筛选到一株能转化柚皮苷为3'-羟基柚皮苷和3',5'-二羟基柚皮苷的真菌菌株NT-02.通过对菌株NT-02的形态学观察和ITS序列系统发育分析,构建了系统发育树,NT-02菌株与哈茨木霉(Trichoderma harzianum/Hypocreaum lixii)形成一个类群,且有99％的同源性,初步鉴定真菌NT-02为木霉属(Trichoderma)菌株.     

一株柚皮苷羟基化真菌的筛选及鉴定

柚皮苷是中草药枳实、橘红的主要有效成分,用于心血管疾病的防治。为了开发生物法生产柚皮苷的羟基化衍生物,从土壤中分离筛选到一株能转化柚皮苷为3’-羟基柚皮苷和3’,5’-二羟基柚皮苷的真菌菌株NT-02。通过对菌株NT-02的形态学观察和ITS序列系统发育分析,构建了系统发育树,NT-02菌株与哈茨木霉（Trichoderma harzianum／Hypocreaum lixii）形成一个类群,且有99％的同源性,初步鉴定真菌NT-02为木霉属（Trichoderma）菌株。     

一株棘孢曲霉的鉴定及其柚苷酶合成规律

【目的】对一株新分离的柚苷酶产生菌株JMUdb058进行鉴定,并研究该菌株柚苷酶合成的基本规律。【方法】利用形态观察、28S rDNA序列分析对JMUdb058进行鉴定;通过反相高效液相色谱测定JMUdb058粗酶液对柚皮苷的水解作用,鉴定其柚苷酶活性;分别用11种碳源和6种氮源进行摇瓶发酵,研究碳源、氮源对该菌株分泌柚苷酶的影响;在固态和液态条件下分别进行发酵,测定该菌株合成柚苷酶的能力。【结果】菌株JMUdb058的菌落形态和显微形态符合曲霉属黑色组的典型形态特征,其28S rDNA序列与棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的相似度达100%;用液态和固态两种发酵方法制得的粗酶液均可将标准溶液中的柚皮苷水解产生普鲁宁和柚皮素,还可有效地水解琯溪蜜柚汁中的柚皮苷;用橘皮苷、柚皮苷、芸香苷和鼠李糖为碳源,胰蛋白胨和豆饼粉等有机物为氮源时可分泌柚苷酶;该菌种在固态发酵中表现出很强的柚苷酶发酵能力,用HPLC法测定的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力分别达到5903和1939 U/gds,用Davis法测定的柚苷酶活力达到72232 U/gds。【结论】本研究首次发现棘孢曲霉能够分泌柚苷酶,含鼠李糖基团的物质可作为其产柚苷酶的诱导物。棘孢曲霉JMUdb058固态发酵产柚苷酶的能力突出,是一种高产柚苷酶的微生物新资源。     

一株产柚苷酶的罗伦隐球酵母的鉴定及柚苷酶表达

【目的】对一株新分离的、产生柚苷酶的疑似酵母菌株Jmudeb008进行鉴定,确定其分类的种属关系,阐明葡萄糖对该菌株表达柚苷酶的影响。【方法】利用形态观察、核酸分析及生理生化实验对Jmudeb008进行种属鉴定;用含有0.5g/L柚皮苷及不同浓度葡萄糖的培养基培养Jmudeb008,通过检测培养过程柚皮苷、柚皮素及葡萄糖浓度的变化研究葡萄糖对Jmudeb008表达柚苷酶的影响。【结果】Jmudeb008的菌落形态及个体形态都与典型的酵母相似,其26SrDNAD1/D2区域和5.8SrDNA-ITS区域的序列与罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)的同源性为99%,葡萄糖发酵试验阴性,尿酶试验阳性,重氮基蓝B试验阳性、硝酸盐还原试验阴性符合该菌种特性,因此鉴定为罗伦隐球酵母。Jmudeb008在以柚皮苷为唯一碳源的培养基中或当培养基中葡萄糖消耗完以后会分泌柚苷酶,而有葡萄糖存在时不分泌柚苷酶。【结论】分离得到了能产柚苷酶的罗伦隐球酵母,该酵母产柚苷酶受葡萄糖分解代谢调节。     

菊花不同花色品种中花青素苷代谢分析

应用高效液相色谱和多级质谱联用技术(HPLC-ESI-MSⁿ), 分析菊花(Chrysanthemum × morifolium)白色、粉色、红色、紫色、红紫色和墨色6个色系共计82个品种中花青素苷合成过程的中间产物和最终产物, 发现从白色、粉色、红色、紫色、红紫色到墨色花青素苷含量快速增加, 分别为4.68、111.60、366.89、543.56、1 220.36和2 674.95 μg·g^–1, 不同色系间花青素苷的含量差异显著(P<0.01), 花青素苷含量越高花色越深; 墨色菊花品种中总类黄酮含量显著高于其它花色品种(P<0.01), 其它不同色系间总类黄酮含量差异不显著(P>0.05); 随着菊花花色变深, 从柚皮素分支到圣草酚的代谢流, 以及从圣草酚分支到矢车菊素苷的代谢流比例增加。花青素苷成分分析发现: 菊花中只含有矢车菊素苷类化合物。根据花青素苷代谢成分分析结果绘制了菊花中花青素苷代谢路径图, 即在菊花类黄酮代谢途径中只存在矢车菊素苷代谢分支途径;菊花不同色系在柚皮素和圣草酚2个关键代谢分支点上向不同方向代谢流的分配比例不同, 造成花青素苷产物含量不同,导致不同花色。以上研究结果为菊花花色改良的分子育种提供了理论依据。     

菊花不同花色品种中花青素苷代谢分析

应用高效液相色谱和多级质谱联用技术（HPLC-ESI-MSn）,分析菊花（Chrysanthemum×morifolium）白色、粉色、红色、紫色、红紫色和墨色6个色系共计82个品种中花青素苷合成过程的中间产物和最终产物,发现从白色、粉色、红色、紫色、红紫色到墨色花青素苷含量快速增加,分别为4.68、111.60、366.89、543.56、1220.36和2674.95μg·g-1,不同色系间花青素苷的含量差异显著（P〈0.01）,花青素苷含量越高花色越深;墨色菊花品种中总类黄酮含量显著高于其它花色品种（P〈0.01）,其它不同色系间总类黄酮含量差异不显著（P〉0.05）;随着菊花花色变深,从柚皮素分支到圣草酚的代谢流,以及从圣草酚分支到矢车菊素苷的代谢流比例增加。花青素苷成分分析发现：菊花中只含有矢车菊素苷类化合物。根据花青素苷代谢成分分析结果绘制了菊花中花青素苷代谢路径图,即在菊花类黄酮代谢途径中只存在矢车菊素苷代谢分支途径;菊花不同色系在柚皮素和圣草酚2个关键代谢分支点上向不同方向代谢流的分配比例不同,造成花青素苷产物含量不同,导致不同花色。以上研究结果为菊花花色改良的分子育种提供了理论依据。     

柚皮中的有效成分对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨柚皮素或柚皮苷对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响。方法柚皮素或柚皮苷(0.250、0.125、0.063g/L)作用于人子宫颈癌Hela细胞后,MTT比色法检测Hela细胞增殖活性和半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);流式细胞术检测柚皮素对Hela细胞凋亡的影响。结果柚皮素能抑制Hela细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性,24、48和72hIC50值分别为0.24、0.11和0.07g/L;柚皮苷无抑制Hela细胞增殖的作用。柚皮素组(0.22g/L、0.11g/L、0.05g/L,作用48h)人子宫颈癌Hela细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000239681,P=0.00012746,P=5.09328E-05,P0.01)。结论柚皮中黄酮类提取物具有抑制人子宫颈癌Hela细胞增殖作用,其中柚皮素作用明显,部分作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。柚皮苷无抗人子宫颈癌作用。     

HPLC法测定牙膏中柚皮苷的含量

建立了高效液相色谱测定牙膏中柚皮苷含量的方法。采用的色谱条件:Hypersil BDS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温为40℃;以水(A相)和乙腈(B相),梯度洗脱程序为:0～15 min,10%～100%B;流速为1.0 mL/min;检测波长为283 nm;进样量为20μL。结果表明,柚皮苷的质量浓度在14.55～116.40μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),平均加标回收率为97.56%。该方法稳定、准确,重现性好,可作为牙膏中柚皮苷的含量测定和质量控制方法。     

柚皮素-7-O-乙酸酯和柚皮素-7-O-丙酸酯的制备及抗血小板聚集活性

为改善柚皮素的水溶性而不降低其抗血小板聚集活性,本文以柚皮苷为原料,经"4'位羟基苄基化-酸水解苷键-酰化-加氢脱苄基"四步反应,合成出柚皮素-7-O-乙酸酯和柚皮素-7-O-丙酸酯。两种衍生物在水中的溶解度分别为637.34±53.23μg/m L和59.74±4.81μg/m L,均高于柚皮素的溶解度。两种衍生物均对二磷酸腺苷诱导的兔体外和大鼠体内血小板聚集有显著的抑制活性,且抑聚率均高于柚皮素。实验结果表明,通过选择酰化柚皮素的7位羟基,引入含1~2个碳的短脂肪烃基链,能显著改善水溶性,提高抗血小板聚集活性。     

洋甘菊中芹菜苷提取工艺研究

洋甘菊因含有丰富生物活性成分,具有多种保健作用而受到人们广泛关注,其中芹菜苷(Apioside)是其主要活性物质。本实验建立了HPLC测定洋甘菊中芹菜苷含量的方法,采用有机溶剂回流法提取洋甘菊中的芹菜苷,并用HPLC测定芹菜苷的含量。在单因素试验的基础上,采用响应面分析法对洋甘菊提取芹菜苷提取条件进行优化。确立了提取的最佳工艺条件:乙醇体积分数为67%,料液比是1∶24,提取温度为72℃,提取时间为2 h。试验证明,此条件下芹菜苷率为2.14%(n=3),与模型预测2.096%基本一致。     

转CiCHS基因拟南芥的黄酮代谢及抗氧化能力分析

该研究克隆了中间锦鸡儿的查尔酮合成酶基因(CiCHS)并转入野生型拟南芥和tt4突变体,用qRT-PCR检测了转基因拟南芥中内源AtCHS基因的表达量,用分光光度法分析了转基因拟南芥的总黄酮、丙二醛含量及DPPH自由基清除能力,用HPLC法检测了转基因拟南芥的柚皮苷含量。结果显示:(1)转基因拟南芥中,内源AtCHS基因的表达量约为野生型的十分之一,总黄酮含量明显高于野生型;HPLC测得转基因株系中柚皮苷含量高于野生型;紫外照射处理前后转基因拟南芥中丙二醛积累量明显少于野生型。(2)转基因株系提取物对DPPH自由基清除能力显著高于野生型。(3)CiCHS基因互补拟南芥tt4突变体,转基因株系的种皮呈现浅棕色。研究表明,中间锦鸡儿CiCHS基因异源表达后生成了柚皮苷,使转基因植物的抗氧化性增强,部分恢复了tt4突变体的种皮颜色。     

产柚苷酶菌株B04的分离及产酶特性研究

柚苷酶作为金柚和柑桔果实中主要苦味物质的分解酶有望在深加工生产中得到应用。本研究在金柚树林下土壤和金柚皮腐烂液中分离得到产柚苷酶菌株。研究证明采用添加低浓度蔗糖作为碳源的高层试管法是可行的初筛方法;复筛得到菌株B04,产酶需要诱导,酶底物柚苷和产物鼠李糖均有诱导作用,其中柚苷诱导作用更好,而且添加量为0.02%时菌株产酶能力较强;B04发酵类型为非生长偶联型,30℃,175r/min旋转摇床培养,60h菌体量最大,96h酶活力最高,达到342U/mL。