BPOZ基因剔除小鼠模型的建立

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因,建立BPOZ基因剔除小鼠模型,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列,设计基因剔除策略,构建完成了基因剔除载体XpPNT-BPOZ.以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得抵抗克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆.将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只,其中15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠,阳性率为50%.在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠.初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常,有繁殖能力,进一步的表型分析工作正在进行之中.     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的：构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将 Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因 R528H 突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

几丁质酶结构域内含蛋白1(Chid1)基因剔除小鼠的建立

建立几丁质酶结构域内含蛋白1(chitinase domain containing 1,Chid1)基因剔除小鼠,观察小鼠表型和发育差异。设计了合适的基因剔除策略,成功构建了基因剔除打靶载体。以电穿孔方法将打靶载体导入ES细胞(embryonic stem cell),用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,挑选抗药的阳性克隆,提取ES细胞基因组DNA,用长臂PCR鉴定出阳性ES细胞。将阳性ES细胞复苏培养后注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的杂合子小鼠。在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠。从脑、脾脏、肝、肺的RNA水平鉴定来看,基因剔除小鼠的Chid1基因未表达,而杂合子、野生型小鼠有明显的该基因条带。经过初步的表型观察发现,Chid1基因剔除小鼠发育正常,未出现胚胎致死,交配繁殖能力无异常。几丁质酶结构域内含蛋白1(Chid1)基因剔除小鼠模型建立成功。Child1基因对于小鼠发育、生殖方面无明显作用。     

利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除的初步研究

对利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除做了初步的探索,为进一步应用该技术进行小鼠基因功能研究奠定了基础.利用基因诱捕载体转染小鼠ES细胞,获得了36株neo基因单拷贝整合的诱捕ES细胞,其中14株细胞表达有活性的β半乳糖苷酶.将3株诱捕ES细胞分别经显微注射引入到受体囊胚中,再植入假孕母鼠的子宫中使其发育成小鼠.两株细胞得到了程度不同的嵌合体小鼠,其中一株诱捕ES细胞整合至生殖系.利用质粒拯救实验获得了诱捕载体整合位点附近的基因组序列,通过序列比对发现被诱捕的基因可能是一个新基因.X-gal染色结果显示,该基因的表达局限于小鼠腹部及肢芽的部位.     

骨保护素(Opg)基因敲除小鼠发生高转换型骨质疏松和动脉钙化

骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变,骨保护素(OPG)可能是联系两者的分子之一.构建替换型载体pXpPNT-OPG,利用同源重组,将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉.通过胚胎干细胞(ES)基因打靶获得了正确重组的ES细胞克隆,ES细胞显微注射后获得嵌合体小鼠,交配传代获得杂合子和纯合子小鼠.RT-PCR和蛋白质印迹实验结果显示,纯合子小鼠没有Opg基因的表达.纯合子小鼠骨量丢失明显,骨生物力学指标明显下降,发生严重的骨质疏松,此外,还有50%以上的纯合子小鼠在早期出现动脉中层钙化.小鼠破骨功能亢进,与此同时,成熟成骨细胞数量增加,矿化功能强于野生型.Opg基因缺失小鼠骨中钙和磷大量流失,而血清中水平没有变化,这提示钙磷代谢异常不是OPG缺失导致动脉钙化的原因.对建立的Opg基因敲除小鼠模型进一步深入的研究,将有助于说明动脉钙化和骨质疏松症相互联系的分子机制,为防治骨质疏松症和动脉钙化的并发提供理论基础支持.     

骨保护素(Opg)基因敲除小鼠发生高转换型骨质疏松和动脉钙化

骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变，骨保护素 (OPG) 可能是联系两者的分子之一. 构建替换型载体pXpPNT-OPG，利用同源重组，将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉. 通过胚胎干细胞 (ES) 基因打靶获得了正确重组的ES细胞克隆，ES细胞显微注射后获得嵌合体小鼠，交配传代获得杂合子和纯合子小鼠. RT-PCR和蛋白质印迹实验结果显示，纯合子小鼠没有Opg基因的表达. 纯合子小鼠骨量丢失明显，骨生物力学指标明显下降，发生严重的骨质疏松，此外，还有50%以上的纯合子小鼠在早期出现动脉中层钙化. 小鼠破骨功能亢进，与此同时，成熟成骨细胞数量增加，矿化功能强于野生型. Opg基因缺失小鼠骨中钙和磷大量流失，而血清中水平没有变化，这提示钙磷代谢异常不是OPG缺失导致动脉钙化的原因. 对建立的Opg基因敲除小鼠模型进一步深入的研究，将有助于说明动脉钙化和骨质疏松症相互联系的分子机制，为防治骨质疏松症和动脉钙化的并发提供理论基础支持.     

小鼠胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式

将PPARγ2基因启动子和报告基因荧光素酶相连接克隆于特定载体构建成表达质粒,电穿孔转染小鼠ES细胞,筛选阳性克隆.诱导ES细胞向脂肪细胞分化,通过定量检测荧光素酶活性跟踪PPARγ2基因的表达情况,以此研究脂肪细胞分化过程中该基因的表达模式.结果显示PPARγ2基因在未分化的ES细胞和EB形成的前两天中不表达,从EB形成的第3天开始表达,直至脂肪细胞分化完成.该基因在已完成分化的脂肪细胞中的表达远强于在分化中的前脂肪细胞中的表达.首次报道了从小鼠ES细胞到脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式,支持了PPARγ2基因为脂肪组织特异性表达基因的已有报道,并为脂肪细胞分化机理研究提供了线索.     

四倍体补偿技术的建立及其应用

常规基因剔除小鼠的获得主要是利用ES细胞的全能性先获得嵌合体小鼠,再利用:ES细胞的生殖系传递能力,通过嵌合体与野生型小鼠的交配获得杂合子小鼠.而四倍体补偿技术则可绕过嵌合体小鼠阶段,直接获得基因修饰杂合子小鼠.利用电融合技术和Piezoelectric microinjecfion显微注射技术建立了四倍体补偿技术,小鼠四倍体胚胎的获得率(电融合率)为(93.01±l.37)%,经体外培养囊胚形成率为(82.49±2.08)%.通过显微注射方法将2种129品系小鼠来源的ES细胞(CJ7和SCR012)注射到四倍体囊胚腔中,获得了完全ES细胞来源的小鼠,ES鼠的获得率分别为2.7%和8.3%.经微卫星DNA检测,成体小鼠的10个被检测组织均为129小鼠来源的.同时,也利用基因修饰的ES细胞进行了研究,获得了2种基因修饰的完全ES细胞来源的杂合子小鼠,部分小鼠具有繁殖能力,经繁育已获得了纯合子,其中凝血因子Ⅷ基因敲除小鼠获得了预期的血友病小鼠表型.上述结果说明四倍体补偿技术可应用于基因修饰小鼠的制备.     

黏蛋白1基因敲除小鼠模型的构建

黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视.为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型.首先,根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFn-pBR322.以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆.挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EⅡa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.初步表型观察未发现Muc1基因敲除相关器官组织结构的异常改变.本研究为MUC1的生物学功能的挖掘,尤其是MUC1在肿瘤发生转移中的作用机制的揭示提供了实验平台.     

BPOZ基因纯合缺失ES细胞系的建立及其生长和分化研究

研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状态.利用3种基因型ES细胞进行细胞生长曲线和3H胸嘧啶核苷参入实验比较其生长速度和增殖能力.以裸鼠荷瘤实验和类胚体形成实验比较BPOZ基因纯合缺失型ES细胞与野生型ES细胞生长分化能力.结果表明,筛选获得两个BPOZ基因剔除的纯合ES细胞克隆;筛选得到的纯合ES细胞中BPOZ基因表达完全缺失,细胞处未分化状态.与野生型ES细胞相比,BPOZ基因纯合缺失型ES细胞生长受抑,增殖能力减弱.BPOZ基因纯合缺失型ES细胞可分化形成类胚体和具备来自3个不同胚层的细胞和组织的畸胎瘤.BPOZ基因剔除使ES细胞生长受抑,对ES细胞分化发育没有明显影响.     

类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程

类胡萝卜素具有多种生物功能,尤其在保护人类健康方面起着重要的作用,如它们是合成维生素A的前体,能够增强人体免疫力和具有防癌抗癌的功效。人体自身不能合成类胡萝卜素,必须通过外界摄入;但类胡萝卜素在许多植物中含量较低,并且很难用化学方法合成。随着类胡萝卜素生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆,运用基因工程手段调控类胡萝卜素的生物合成已成为可能。本文综述了微生物和高等植物类胡萝卜素生物合成途径中相关基因的克隆,以及运用这些基因通过异源微生物生产类胡萝卜素和提高作物类胡萝卜素含量的基因工程研究进展。     

乔丹基因:在团藻中发现的跳跃基因

Ｄａｖｉｄ Ｋｉｒｋ 和 Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｍ ｉｌｌｅｒ 最近用一种特殊的转座子 乔丹基因作为标记克隆了两个控制团藻发育的重要基因：ｇｌｓ Ａ 基因和 ｒｅｇ Ａ 基因⒚他们的这一工作可能为遗传学研究开辟了一条新的道路⒚     

硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位

将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BCl2转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BCl2的转化子细胞抽提液分别与琉霉素生物合成阻断变株Y,发酵液以及纯化的Y。中间产物经过体外共培养可产生活性物质．化学分析表明与Y,发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y。中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质。说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y。中间产物为底物并弥补了Y,中的缺陷。对p6Bcl2中4．5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱．利用含硫霉素环化酶基因的S．Lividans TK24转化子体外转化Y,的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0．9kb Hinc I—Pst I片段上,并证明了硫霉紊环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究琉霉素环化酶基因的结构打下了基础。     

MADS-box基因家族基因重复及其功能的多样性

基因的重复(duplication)及其功能的多样性(diversification)为生物体新的形态进化提供了原材料。MADS-box基因在植物(特别是被子植物)的进化过程中发生了大规模的基因重复事件而形成一个多基因家族。MADS-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用,在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。探讨MADS-box基因家族的进化历史有助于深入了解基因重复及随后其功能分化的过程和机制。本文综述了MADS-box基因家族基因重复及其功能分化式样的研究进展。     

大绿蛙Sox基因和Dmrt基因的序列分析

Sox基因家族与Dmrt基因家族在胚胎发育及性别分化中起着重要作用。采用PCR方法,扩增了大绿蛙Sox基因和Dmrt基因的保守区,分别获得长约220 bp和140 bp的片段。序列分析表明,大绿蛙雌雄个体之间Sox基因、Dmrt基因序列没有差异,与人和其它动物的Sox基因、Dmrt基因有非常高的相似性,显示了Sox基因及Dmrt基因在系统进化上的高度保守性。本研究为探讨大绿蛙的性别决定机制及Sox基因与Dmrt基因的进化提供了分子资料。     

基因打靶突变小鼠与基因功能研究

ES细胞是建立基因打靶突变小鼠的必要条件 ,也可用于制备转基因动物 .基因敲除、精细突变和条件性基因打靶技术建立的基因打靶突变小鼠在人类遗传病机理研究、基因治疗和基因功能研究方面都有着重要作用 .     

Smad7基因的克隆、表达及对c-myc基因的调控

Smad7是TGr-β家族信号转导通路的抑制分子,可反馈调节TGF-β／Smads信号转导通路,从功能推测,Smad7表达紊乱,可影响细胞对TGF-β的应答,从而促进细胞的恶性化进展,为了深入探讨Smad7基因功能,通过设计引物,用Touchdown巢式．PCR法从人胎脑文库中扩增Smad7基因编码区全长,回收产物,克隆并构建真核表达载体,同融合有报告基因的c-myc顺式增强子元件共转染BEP2D细胞,结果表明：TGF—p可抑制c．myc报告基因的活性,Smad7基因可正调控c．myc报告基因的表达,并拮抗TGF．B对该基因的抑制作用．由此得出结论：Smad7基因通过桔抗TGF．B来调控c．myc基因、     

应用果蝇yellow基因的分子模式分析基因转应作用(英文)

基因转应作用（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）是基因表达的一种方式,这种方式是由等位基因配对及其相互作用所介导的。基因转应作用的现象已在果蝇的多种基因中发现。这种作用可产生正负两种效应。而且,在其它物种中,也逐渐发现了类似的现象。例如,在植物中的基因沉默现象（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）以及在小鼠中的基因转激活作用（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）等。因此,阐明基因转应作用的机理,将有助于了解基因表达调节及增强子调控活动的分子基础。本文应用果蝇ｙｅｌｏｗ基因为模式来探讨基因转应作用的分子机制。前期研究表明,ｙｅｌｏｗ基因转应作用发生于ｇｙｐｓｙ诱导的ｙ２突变种和ｙｅｌｏｗ亚等位基因（ｙｈ）之间。为了证实是否ｇｙｐｓｙ是基因转应作用所必需的ＤＮＡ元件,我们鉴定了一种新的ｙｅｌｏｗ突变种,称为ｙ２３７４。ｙ２３７４突变是一种基因表达的组织特异性改变,这一改变使ｙ２３７４果蝇在翅和身体部位表皮着色呈突变型。通过遗传分析表明,ｙ２３７４也可与ｙｈ（如ｙ１＃８）产生基因转应作用。ｙ１＃８是一种无效的ｙｅｌｏｗ等位基因,它包含一个启动子和部分编码区序列的缺失。然而,当ｙ２３７４与ｙ１＃８杂交后,其杂交后代的表现型可由ｙ２３７     

Rb、P53调控平滑肌细胞c-fos和c-jun基因表达

为研究外源性Rb和P₅₃基因导入血管平滑肌细胞后对c-fos和c-jun基因表达的调控作用,将Rb基因或P₅₃基因重组腺病毒载体转染人脐动脉血管平滑肌细胞,应用RT-PCR和免疫组化法检测c-fos、c-jun的mRNA及蛋白质表达水平,以DNA琼脂糖凝胶电泳和β-半乳糖苷酶染色分别观察细胞凋亡和细胞衰老.结果显示,野生型P₅₃基因导入可诱导平滑肌细胞凋亡,c-fos和c-jun mRNA及蛋白质表达水平显著增高.外源性Rb基因导入能促进细胞衰老,下调c-fos基因表达,但对c-jun基因表达没有明显影响.