黏蛋白1基因敲除小鼠模型的构建

黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视.为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型.首先,根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFn-pBR322.以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆.挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EⅡa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.初步表型观察未发现Muc1基因敲除相关器官组织结构的异常改变.本研究为MUC1的生物学功能的挖掘,尤其是MUC1在肿瘤发生转移中的作用机制的揭示提供了实验平台.     

逆转录病毒载体pOZ-KLF5的构建及鉴定

为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能,构建了C端带有FLAG、HA、6x His三标签的p OZ-KLF5真核表达逆转录病毒载体。p OZ-KLF5载体可通过一次转录得到双顺反子转录单位,即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质:三标签融合蛋白KLF5-3x Tag和筛选标记——白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)。通过偶联IL-2Rα抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3x Tag表达阳性的293T细胞,经Western-blot检测细胞内KLF5-3x Tag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响,发现KLF5-3x Tag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多,且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解,与已有报道一致。进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。