从广西蚕区分离的家蚕质型多角体病毒生物学特征研究

【背景】家蚕中肠型脓病是一种传染性强、危害大的病毒病,其病原为家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）,该病原抗逆性强、宿主域广,防控难度大。【目的】调查广西蚕区家蚕中肠型脓病发生情况,并研究家蚕质型多角体病毒的感染性、形态特征和分子鉴定,为养蚕生产中有效防控该病提供参考依据。【方法】通过外观和解剖观察病症与显微镜检验相结合,调查养蚕生产家蚕中肠型脓病的发生率;采用生物试验方法测定多角体病毒对家蚕的半数感染浓度（IC₅₀）;利用光学显微镜和扫描电镜观察多角体病毒的外部形态,利用透射电子显微镜观察多角体病毒的内部结构;采用PCR扩增和测序进行分子鉴定。【结果】广西蚕区家蚕中肠型脓病普遍存在,金城江蚕区和东兰蚕区的家蚕中肠型脓病平均发生率分别为6.06%和13.02%,最高发生率达到30.41%;分离获得2株BmCPV病原（暂命名为BmCPV-J和BmCPV-D）,它们的半数感染浓度（IC₅₀）分别为4.88×10³ PIBs/mL和1.63×10⁴ PIBs/mL,都具有很强的致病性;2株BmCPV的形态均为六角形多角体,大小有差异,多角体直径为1.0-3.4 μm;从2株BmCPV内部结构观察到球形病毒粒子,直径为30-50 nm,有刺状突起;可以扩增出BmCPV-J和BmCPV-D的RNA复制酶基因目的片段,BmCPV-J的目的片段序列与BmCPV参考株一致,而BmCPV-D的目的片段序列与参考株有2个碱基的差异。【结论】广西蚕区家蚕中肠型脓病危害严重,该病病原感染力强、分布广,多角体病毒具有典型的质型多角体病毒特征,属于家蚕质型多角体病毒。研究结果为养蚕生产中有效防控家蚕中肠型脓病提供重要依据。     

不同生长阶段家蚕1-脱氧野尻霉素富集与食桑量的相关性研究

为了研究家蚕富集1-脱氧野尻霉素(DNJ)的机制,采用柱前衍生化高效液相色谱法分析不同生长阶段家蚕及其代谢产物和所食桑叶中DNJ的含量,研究家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素富集与食桑量的相关性。结果显示不同生长期家蚕及其副产物中DNJ的累积量有较大差异,且呈一定规律性变化,先上升后下降,于四龄时最高。家蚕幼虫期蚕体及其副产物中DNJ总累积量与其在该阶段所食桑叶中DNJ总量相当,且家蚕的任一成长发育阶段(蚁蚕和熟蚕不吃桑叶除外),其蚕体DNJ含量均大大高于桑叶中的DNJ含量,表明家蚕具有累积或富集DNJ的机能,本研究结果为进一步研究家蚕富集DNJ的机制提供了理论依据。     

家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的相关蛋白分析

家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)病的机制,通过对BmNPV高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗,敏感及近等基因系5龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电泳 (two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 分析,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间 (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight, MALDI-TOF) 质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了5个差异表达的蛋白。推测这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。     

家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中。qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6 h时家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3的表达量最高;siRNA抑制NbTre3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化。【结论】结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用。     

一种家蚕类浓核病毒的组织病理学特征

本文从家蚕病蚕中分离到一种家蚕类浓核病毒（BmDNV-Like）,对它的组织病理学研究表明:该病毒首先寄生家蚕中肠柱状细胞,继而引起其细胞核的膨大和破裂;组织原位杂交结果表明该病毒既能在家蚕中肠柱状细胞中增殖,也能在中肠的杯形细胞中增殖,甚至在感染后期能在家蚕幼虫的大部分组织细胞中感染和增殖。     

溴虫腈对家蚕和桑树害虫的毒力比较

为了比较溴虫腈在家蚕Bombyx mori和桑树害虫间的选择性毒力,采用食下毒叶法测定了溴虫腈、二嗪磷、敌敌畏、辛硫磷和三唑磷5种杀虫剂对家蚕的毒性;用浸叶法测定了5种杀虫剂对桑尺蠖Phthonandria atrilineata Butler、桑螟Diaphania pyloalis Walker和桑毛虫Porthesia xanthocampa Dyer 的毒力;在桑园喷施溴虫腈检测了其在桑树上对家蚕的残留毒性期;通过食下毒叶法系统研究了溴虫腈对家蚕生长发育的影响。结果表明,二嗪磷、敌敌畏、辛硫磷和三唑磷72 h对家蚕的毒性倍数分别大于溴虫腈的15.5、93.3、154 .0和188.5倍;溴虫腈、三唑磷、辛硫磷和敌敌畏48 h相对于二嗪磷对桑尺蠖的毒力倍数分别是49.1、3.2、2.3和1.4倍,对桑螟的毒力倍数分别是79.4、3.6、2.4和1.8倍,对桑毛虫的毒力倍数分别为67.2、3.2、2.2和1.7倍;对桑树喷施100、50、25和12.5 mg/L 溴虫腈,桑叶的残留毒性期分别为3、0、0和0天;用溴虫腈100、50、25和12.5 mg/L 处理的桑叶饲喂家蚕后,存活幼虫的历期、眠蚕体重、熟蚕体重、全茧量、茧层量、蛹重和化蛹率与对照相比均无显著性差异。据此认为溴虫腈是适合防治桑园害虫又对家蚕较安全的药剂。     

氚标记睾丸酮在家蚕体内的吸收和分布

在家蚕Bombyx mori L.的五龄起蚕期,添食氚标记的雄性激素丙酸睾丸酮(代号³H-TP),用液体闪烁谱仪探查五龄期蚕体对³H-TP的吸收与排泄、贮存与分布及雌雄间的差异.结果证明:蚕体对³H-TP的排出率在添食后24小时达峰值,累计吸收率雄性为85.81%、雌性为68%,雌雄间有明显差异.蚕体内务组织器官对³H-TP的吸收也有显著不同,中肠、血液在添食后2小时,脂肪体在72小时、体壁在48小时,其放射活性为最大值,雌雄间均无明显差异;生殖腺则在添食后168小时达峰值,且雄性显著高于雌性;丝腺中相对含量比较稳定,雌雄之间无较大差异.³H-TP在蚕体各组织器官中的贮存与分布表现为:五龄初期(添食后2小时)以中肠和血液最多,共达85%左右;五龄中期(添食后96小时)以性器官最高(28%左右);五龄末期(添食后192小时)性器官中高达34.58%,且雄性(40.4%)显著高于雌性(28.74%).上述研究结果说明,在家蚕五龄起蚕期添食³H-TP,能被蚕儿多量吸收和贮存在体内,其中尤以生殖器官的相对含量最多,雌雄间亦有明显差异.由此表明,雄性激素可能对家蚕具有某种生理活性.     

氚标记睾丸酮在家蚕体内的吸收和分布

在家蚕Bombyx mori L.的五龄起蚕期,添食氚标记的雄性激素丙酸睾丸酮(代号³H-TP),用液体闪烁谱仪探查五龄期蚕体对³H-TP的吸收与排泄、贮存与分布及雌雄间的差异.结果证明:蚕体对³H-TP的排出率在添食后24小时达峰值,累计吸收率雄性为85.81%、雌性为68%,雌雄间有明显差异.蚕体内务组织器官对³H-TP的吸收也有显著不同,中肠、血液在添食后2小时,脂肪体在72小时、体壁在48小时,其放射活性为最大值,雌雄间均无明显差异;生殖腺则在添食后168小时达峰值,且雄性显著高于雌性;丝腺中相对含量比较稳定,雌雄之间无较大差异.³H-TP在蚕体各组织器官中的贮存与分布表现为:五龄初期(添食后2小时)以中肠和血液最多,共达85%左右;五龄中期(添食后96小时)以性器官最高(28%左右);五龄末期(添食后192小时)性器官中高达34.58%,且雄性(40.4%)显著高于雌性(28.74%).上述研究结果说明,在家蚕五龄起蚕期添食³H-TP,能被蚕儿多量吸收和贮存在体内,其中尤以生殖器官的相对含量最多,雌雄间亦有明显差异.由此表明,雄性激素可能对家蚕具有某种生理活性.     

中西兽医结合诊治马骡肠黄

肠黄(或称急肠黄,西兽医叫急性胃肠炎)是马骡比较常见的一种大肠疾病,属热症。特点是发病急、来势猛、病程短、死亡率高。根据病情轻重,分为轻症、重症和危症三种。 轻症 病畜全身情况较好,口色不红,无舌苔,脉象变化不大,仅肠音增强,泻粪稀臭。 重症 体温高,心率加快,饮多食少,泻粪稀臭,口色红或赤,舌面有苔,脉沉数,肠音减弱或消失。     

家蚕浓核病毒 (中国镇江株)在不同感受性宿主体内的复制

家蚕浓核病毒中国镇江株是一株双生浓核病毒(bidensovirus)。其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒(BmDNV-1伊那株)表现相似,病蚕软化,中肠的圆筒型细胞呈浓核症。该病毒的最大特点是基因组中含有二套DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链( VD1,-VD1, VD2,-VD2)线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中,成为四种病毒体,而且它自身编码DNA聚合酶。有部分蚕品种对该病毒表现完全抗性,即不发病。分别对敏感性家蚕品种(华八35)和抗性家蚕品种(秋丰d)的幼虫进行经口接种病毒。在接种后,从2h到96h分9个时间点,对中肠组织进行取样。以家蚕细胞质肌动蛋白A3(actinA3)基因作为参比基因,用来标定取样组织细胞数。针对VD1和VD2分别设计特异引物,用荧光定量PCR的方法分别检测各个时间点的样品中的病毒基因组VD1和VD2拷贝数。结果表明:无论是在感性还是在抗性宿主体内,家蚕浓核病毒中国株的基因组VD1和VD2在各时间点拷贝数相近,表现出VD1和VD2是同步复制的;病毒侵入两种宿主中肠的初始量(接种后2h)基本相等,每个细胞约为6~10拷贝数。在敏感性宿主体内病毒感染过程表现为潜伏期,指数增长期,平台期。从接种后2h到12h为病毒潜伏期;12h到36h为指数增长期,倍增时间为1·71h,大约扩增15次;36h到96h为平台期,进入平台期病毒的拷贝数达到20万个。在抗性宿主体内病毒处于一种极低水平的增殖,从添毒后2h的6~10拷贝数到96h的150~200拷贝数,病毒复制倍增时间分别为3h和12h,大约扩增5次。推测家蚕对浓核病毒中国株的抗病性,只是一种慢性的带毒不发病的表现。     

摄入异烟肼对家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原循环和谷胱甘肽S-转移酶活性的影响

为了建立家蚕Bombyx mori的药物筛选和毒性评价模型, 以剂量为2 000 mg/kg的抗结核模药异烟肼饲喂家蚕5龄第3天幼虫后检测其中肠和脂肪体的抗氧化解毒相关代谢的变化。结果表明： 雌蚕中肠组织中, 总谷胱甘肽(GSH+2GSSG)、 还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)含量均呈现迅速上升再缓慢下降趋势; 谷胱甘肽S 转移酶(glutathione S-transferase, GST)活性升高到较大值后逐渐降低; GSH/GSSG的比值下降表明, 在72 min后中肠组织向氧化态转移。脂肪体组织中, 总谷胱甘肽、 GSH和GSSG含量变化均呈现迅速下降再迅速上升的趋势; GST活性达到最大值后逐渐降低后趋于平稳; GSH/GSSG比值升高表明, 在72 min后脂肪体组织向还原态转移。无论雌蚕还是雄蚕, 总谷胱甘肽、 GSH和GSSG含量以及GST活性均是脂肪体高于中肠。雌蚕的总谷胱甘肽含量、 GSH和GSSG含量高于雄蚕, 但雄蚕的GST活性高于雌性。结果说明, 摄入异烟肼引起了家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原状态的改变和酶活性的变化, 在这个过程中脂肪体起主要解毒代谢作用。     

应用抗保幼激素活性物质“抗11”调控家蚕生长发育的研究初报

本文报道应用抗保幼激素生理活性物质“抗11”调控家蚕生长发育的初步试验结果。从3龄饷食开始,连续添食300～500ppm药液48小时;或以400～500ppm的药液浓度给4龄起蚕连续添食48小时,3眠蚕诱发率可达100％。3龄或4龄添食,当龄历期延长,但全龄历期均比对照区缩短,如4龄添食区缩短近5日,所诱发的3眠蚕能结茧、化蛹、羽化、交配、产卵,所结的茧小,量低,纤度变细。     

云南家蚕核型多角体病毒分离株的毒力测定及系统进化分析

【目的】由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染家蚕Bombyx mori导致的核型多角体病(血液型脓病)在云南蚕区普遍发生,危害严重,给云南蚕业带来严重的经济损失。本研究旨在测定云南不同蚕区BmNPV分离株的毒力及了解BmNPV在云南的病害流行趋势,为监测和控制云南家蚕血液型脓病打下基础。【方法】通过BmNPV对家蚕5龄幼虫致死率和对家蚕BmN细胞毒力的测定评价了云南蚕区19个BmNPV分离株的致病力;对19个云南BmNPV分离株的bro-d基因进行克隆、测序及系统进化分析。【结果】BmNPV对家蚕5龄幼虫的致死率测定表明,云南不同地区BmNPV毒株对家蚕的口服感染力差异较大;细胞毒力测定结果显示不同BmNPV分离株的出芽型病毒粒子(budded virus, BV)滴度差异较大。进化分析表明,所获取来自云南的19个BmNPV分离株主要分为两个亚群,亚群I在云南省的东部、中部和西部地区均有分布,而亚群II主要集中分布于云南省北部地区。从地理分布图可以看出,亚群I所在地区多为亚热带,温度偏高;而亚群II所处的云南北部地区多为典型高原季风气候,温度相对偏低。【结论】云南蚕区存在丰富的BmNPV株系,各分离株对家蚕的毒力差异较大;云南BmNPV分离株的进化关系在一定程度上与地理气候密切相关。     

应用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测家蚕核型多角体病毒的研究

由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopoyhedrosis virus,BmNPV)侵染家蚕Bombyx mori引起的家蚕核型多角体病(血液型脓病)在养蚕生产中发生较为普遍,对蚕业生产造成重大的经济损失。本研究建立了快捷有效的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)用于快速检测BmNPV,为蚕业生产提供了一个有效检测BmNPV和进行早期诊断的技术。该方法是针对BmNPV的pe38基因的6个区段设计的6条引物用于扩增检测,整个反应在恒温条件63℃下进行25 min,扩增产物用电泳法和可视法检测(用SYBR Green I染色)。结果显示,LAMP检测方法的灵敏度是常规PCR方法的100倍,能检测的范围为21个拷贝。另外,用4.86×108OBs/mL感染4龄起蚕,提取血淋巴DNA为模板,PCR在感染36 h后检出病毒DNA,LAMP法能检测感染12h后的样品。     

双链核糖核酸病毒的研究 Ⅱ.家蚕细胞质多角体病毒免疫学的研究

按前报用分子筛凝胶柱层析纯化家蚕细胞质多角体病毒(Cytoplasmic polyhedrosis virus,以下简称CPV)作为抗原制备了兔抗血清。对接种CPV后不同时间的家蚕中肠组织内CPV的增殖过程进行了观察,表明利用免疫对流电泳在CPV感染后的12～20小时(即病毒在病蚕中肠组织内增殖初期)就可检出。家蚕CPV的抗血清与其他几种昆虫的CPV有免疫交叉反应,但当家蚕CPV的抗血清经双链多聚核苷酸(肌苷酸/胞嘧啶核苷酸,即poly I/poly C)吸收后,则与其他几种昆虫CPV的交叉反应即行消失。     

对人工饲料摄食性不同的家蚕品种Cph2基因的表达特征分析

家蚕Bombyx mori不同品种对人工饲料的摄食性存在很大差异。为探讨食性差异的分子机理, 本文基于对人工饲料摄食性不同的蚕品种（系）SAGE （serial analysis of gene expression）文库差异表达基因的分析, 发掘了1条家蚕假定表皮蛋白（cuticular protein hypothetical）基因BmCph2。采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法, 对BmCph2在不同摄食性蚕品种（系）不同发育时期的表达特征进行了研究。结果表明： BmCph2基因在家蚕幼虫眠期和起蚕期高表达, 在胚胎期和幼虫将眠期几乎检测不到表达; 在幼虫头部与全蚕的表达特征相似, 而在中肠中表达活性很低, 推测该基因表达可能与家蚕新表皮的形成有关。BmCph2在对人工饲料摄食性不同的蚕品种（系）中的表达存在较大差异, 在摄食性好的高食性品种中表达量显著低于摄食性差的低食性品种; 饲料和忌避剂的气味刺激及取食刺激对不同品种（系）该基因的表达有不同的影响, 高食性蚕对诱导刺激比较敏感, 而低食性蚕受影响较小, 尤其是菁松A和菁松B的低食性品系几乎不受影响。本研究结果说明, BmCph2基因除可能参与表皮形成的同时, 还与家蚕的食性有密切关系, 但其具体机理有待于进一步研究。     

家蚕抗核型多角体病毒病育种研究进展

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus,BmNPV)病是蚕业界上最常见、危害比较严重的病害;遗传学研究和抗性分析表明,家蚕对核型多角体病毒抗性由主效基因和微效基因协同控制。在蚕病防治方面,除了加强消毒以外,选育抗病毒新品种无疑是更加经济有效的办法。近年来,随着基因组学和新一代测序技术的迅猛发展,覆盖深度达8.5倍家蚕基因组图谱完成和40个家蚕品种和野生种重测序的完成,为家蚕的抗核型多角体病毒病育种提供了理论依据和基因资源。本文综述了BmNPV基因组研究、家蚕基因组研究以及家蚕抗性品种培育方面取得的进展。     

桑天牛卵长尾啮小蜂的寄主选择定位行为

本文对桑天牛卵长尾啮小蜂Aprostocetus prolixus LaSalle et Huang的寄主选择定位行为进行了系统研究。已有研究表明,寄主植物-寄主昆虫复合体释放的挥发物对寄生蜂有显著的引诱作用。为了查明寄主植物 寄主昆虫复合体中挥发性引诱物质的来源,对不同处理桑枝（正常桑枝、机械损伤桑枝、系统枝、桑天牛Apriona germari（Hope）咬食和产卵桑枝）、桑天牛虫粪及雌雄两性桑天牛所释放的挥发物分别进行了测定。结果显示：不同处理桑枝对寄生蜂都具有显著的引诱作用,而且产卵桑枝的引诱活性最大;桑天牛虫粪的气味对寄生蜂有引诱活性,而雌、雄桑天牛体表挥发物对寄生蜂的引诱效果不明显。桑天牛爬行痕迹对寄生蜂的微栖境接受行为没有影响,而桑天牛虫粪中的信息物质在寄生蜂的微栖境接受过程中起着重要作用。寄生蜂对产卵桑枝段的选择几率明显高于正常桑枝段和咬食桑枝段,而对不同植物上产卵刻槽的选择没有差异; 刻槽表面存在着与此卵寄生蜂寄主识别相关的信息物质。     

免疫酶技术在家蚕病理研究上的应用

<正> 免疫酶技术是60年代发展起来的一项灵敏的免疫测定技术。近几年来,我们把免疫酶技术应用于家蚕病理方面,进行了家蚕浓核病毒(DNV)的定位研究和不同来源病毒的鉴定,建立了酶联对流免疫电泳早期诊断技术,取得了良好的结果,现介绍如下。 一、高纯度病毒抗原及其抗血清的制备取浓核病蚕中肠去除内容物,加磷酸缓冲液(0.05mol、pH7.2)制成匀浆,在5℃中12000rpm离心去沉淀,取上清液与等体积的冷氯仿混合,振摇离心(5000rpm)后收集上层病毒     

全细菌SELEX法筛选粪肠球菌特异性适配体

肠球菌（Enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌,检出率仅次于大肠杆菌,从分子水平上发展靶标的高亲和力分子探针对肠球菌的识别和检测具有非常重要的意义。本研究以粪肠球菌为靶标,运用全细菌指数富集的配体系统进化技术（whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment, whole-bacteria SELEX）,从全长为79个核苷酸包含35个随机碱基序列的单链DNA文库中筛选与靶标高亲和力、高特异性结合的适配体,利用荧光分析法监控筛选过程中不同轮次所得次级文库与粪肠球菌的结合力,经12轮筛选和克隆测序,获得了39条适配体序列。进一步对筛选得到的适配体进行序列比对、二级结构分析、流式细胞分析、解离常数（Kd）测定及特异性验证,最终获得一条与粪肠球菌能特异性结合的适配体Apt 21,其Kd值为549.2 ± 147.4 nmol/L。该适配体可作为粪肠球菌检测的识别元件,为建立基于适配体的新型粪肠球菌检测方法奠定了基础。