转基因家蚕的研究进展及应用前景

转基因家蚕Bombyx mori是指利用分子生物学手段,将外源基因转移到家蚕染色体中, 使之出现先前不具有的性状和产物,并且可以保持传代,在个体水平可以体现外源基因的功能,使外源基因获得大量表达。目前转基因家蚕研究主要以piggyBac转座系统为常用载体, 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因为常用报告基因,经显微注射法获得转基因家蚕的成功率可达40%。通过转基因家蚕技术已经探明了家蚕外源导入核受体基因BmFtz-F1,调控家蚕体壁半透明的BmBLOS2基因、蜕皮启动激素(ecdysis-triggering hormone, ETH)基因以及家蚕抗菌肽CecB(cecropin B)基因的功能;获得了具有高品质、高细纤度、高拉伸强度和高弹性丝品种,能吐带绿色荧光或粉红色荧光的蚕丝品种, 抗家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)品种及抗藤黄微球菌的品种;成功表达纯化了人的Ⅲ型前胶原蛋白、 人碱性纤维生长因子、人血清蛋白、人脑源性神经营养因子、人胰岛素生长因子Ⅰ、猫干扰素、单克隆抗体等生物活性蛋白、疫苗及特殊的生物材料。随着家蚕转基因技术的深入研究, 转基因家蚕产物将在国防、 军工、 航天、 医药等方面有着更为广阔的应用前景。     

转录调控因子Fox的功能及分子机制研究进展

Fox (Forkhead box)蛋白家族有19个亚族, 它们通过结合DNA, 激活或抑制目的基因的转录活性, 同时还能参与细胞信号转导、 细胞周期调控和新陈代谢的调节, 在生物体发育及其成熟的组织器官中均能发挥重要作用, 目前, 有关Fox蛋白家族的功能及分子机制已逐步成为免疫学、 遗传学、 医学以及肿瘤学领域的研究热点。本文综述了Fox家族成员的命名及分类、 蛋白结构及其DNA识别机制以及该家族成员如何参与Hh, TGF-β/SMAD, MAPK, Wnt/β-catenin和IGF信号通路的调控。Fox家族可调控线虫的咽、 果蝇的唾液腺以及哺乳动物的肝脏和眼睛等器官的发育, 能够影响细胞周期, 其家族成员FoxA可以和CREB、 GR结合调控新陈代谢。不同物种的Fox家族成员个数存在差异, 并且受到严格的进化选择。对其功能和分子进化机制进一步研究可为阐明生物的发育机理和人类疾病的防治提供新的思路。     

对人工饲料摄食性不同的家蚕品种Cph2基因的表达特征分析

家蚕Bombyx mori不同品种对人工饲料的摄食性存在很大差异。为探讨食性差异的分子机理, 本文基于对人工饲料摄食性不同的蚕品种（系）SAGE （serial analysis of gene expression）文库差异表达基因的分析, 发掘了1条家蚕假定表皮蛋白（cuticular protein hypothetical）基因BmCph2。采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法, 对BmCph2在不同摄食性蚕品种（系）不同发育时期的表达特征进行了研究。结果表明： BmCph2基因在家蚕幼虫眠期和起蚕期高表达, 在胚胎期和幼虫将眠期几乎检测不到表达; 在幼虫头部与全蚕的表达特征相似, 而在中肠中表达活性很低, 推测该基因表达可能与家蚕新表皮的形成有关。BmCph2在对人工饲料摄食性不同的蚕品种（系）中的表达存在较大差异, 在摄食性好的高食性品种中表达量显著低于摄食性差的低食性品种; 饲料和忌避剂的气味刺激及取食刺激对不同品种（系）该基因的表达有不同的影响, 高食性蚕对诱导刺激比较敏感, 而低食性蚕受影响较小, 尤其是菁松A和菁松B的低食性品系几乎不受影响。本研究结果说明, BmCph2基因除可能参与表皮形成的同时, 还与家蚕的食性有密切关系, 但其具体机理有待于进一步研究。     

家蚕素Ⅱ基因原核表达及蛋白纯化

【目的】建立一种简便、 快速且能大量获得家蚕素Ⅱ （bombyxin-Ⅱ, BBXⅡ）的有效方法。【方法】运用RT PCR技术得到bombyxin-Ⅱ基因全长cDNA序列, 采用原核表达技术对该基因进行异源表达, 并利用亲和层析的方法得到纯化的BBXⅡ蛋白。【结果】从家蚕Bombyx mori头部mRNA中经过反转录获得bombyxin-Ⅱ基因的cDNA, 并构建了原核表达载体pET28a-BBXⅡ, 经过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导, 使BBXⅡ获得了大量表达, 进一步用HisTrap HP亲和层析, 成功得到大量纯化的BBXⅡ。【结论】本实验建立的原核表达方法和蛋白纯化技术, 是大量制备BBXⅡ的一种简易而有效的方法, 为进一步开展BBX的分泌机制和作用机理研究, 以及利用原核表达系统研发BBX降血糖药物奠定了基础。     

家蚕神经系统研究进展

家蚕Bombyx mori神经系统属于腹神经索型, 构造简单, 却能产生丰富的行为, 是研究神经生物学的理想实验材料。研究表明： 家蚕神经系统由中枢神经系统、 外周神经系统和交感神经系统构成, 通过信号传递在调节家蚕视觉、 嗅觉、 取食、 结茧、 交配、 排泄等生命活动中发挥作用。家蚕具有编码乙酰胆碱、 γ-氨基丁酸、 多巴胺等多种神经递质及其受体和促前胸腺激素（prothoracicotropic hormone, PTTH）、 滞育激素（diapause hormone, DH）等神经肽的基因。家蚕神经系统发育受到许多基因和bmo-miR-92等小分子RNA的调控。目前研究家蚕神经的方法主要有触角电位技术、 免疫细胞化学法、 转基因方法、 神经信息学及计算机三维重建等。对家蚕神经系统的研究有助于阐明神经系统的信号传递机制和生物神经网络的形成机制。     

昆虫非典型嗅觉受体Orco的功能和分子结构研究进展

嗅觉受体是参与昆虫嗅觉识别过程的一类重要蛋白。在昆虫的众多嗅觉受体中, 有一类受体明显不同于其他受体, 被称为Orco。该受体基因在不同昆虫种间高度保守, 且表达广泛。Orco在昆虫嗅觉识别过程中发挥关键作用。采用基因突变或RNAi等技术使Orco基因沉默后, 昆虫会出现严重的嗅觉缺陷, 但Orco本身不与气味配体结合, 它与传统嗅觉受体形成复合体Or-Orco, 促进传统嗅觉受体在神经元树突膜上的定位并维持其稳定性, 提高传统嗅觉受体对气味反应的效率。昆虫嗅觉受体的结构与脊椎动物的G蛋白偶联受体相似, 均有7个跨膜区, 但二者的膜拓扑结构相反, 昆虫嗅觉受体的N末端位于细胞质膜内, C末端在细胞质膜外, Orco与传统嗅觉受体通过保守的C末端区域相互作用形成一种新型的配体门控离子通道--Or-Orco复合体。阐明Orco在昆虫嗅觉识别中的功能机制, 可为开创基于昆虫嗅觉行为干扰的新的害虫防治措施提供基础。     

利用原核表达系统制备家蚕非典型嗅觉受体Orco抗原蛋白

【目的】探索建立一种有效制备昆虫非典型嗅觉受体Orco抗原的方法,为Orco蛋白组织定位及功能研究奠定基础。【方法】设计带有BamH I和Hind III酶切位点的引物,采用RT-PCR方法扩增家蚕Bombyx mori Orco第 4-5跨膜区之间的基因片段,将其与原核表达载体pET-28a(+)双酶切处理后进行连接,然后转化大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞DH5α,重组质粒再转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE检测诱导蛋白,用 HisTrap HP亲和层析对诱导表达的大量蛋白进行纯化。【结果】 在大肠杆菌原核表达系统中,用IPTG诱导获得了与预测蛋白大小相符的目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现目的蛋白以包涵体形式表达,在变性条件下经HisTrap HP亲和层析获得大量可用于抗体制备的纯化蛋白。【结论】利用原核表达系统可获得制备家蚕Orco抗体的抗原蛋白。