对牛,羊,人包虫囊液成份及抗原性的研究

诊断人、畜包虫病的免疫学方法主要以包虫囊液作抗原,但存在一定的非特异反应。研究包虫囊液生化成份及抗原性,有助于选择适宜的包虫囊液供作免疫实验,以及纯化包虫囊液粗抗原,可提高免疫诊断方法的特异性。本文收集牛、羊、人包虫囊液对抗原的生化成分及免疫性进行了研究。现报道如下:材料与方法一、包虫囊液:将收集的包虫囊液经3000rpm离心30分钟,取上清液存于-20℃备用。二、抗血清:将囊液离心收集原头节,制成匀浆。浸提后10000rpm离心30分钟,上清液蛋白含量为2.8mg/ml(Lowry法)。多点注射免疫家兔。抗血清阳性滴度ELISA为1/12800,对…     

核多角体病毒(NPV)感染的家蚕中肠DNA多聚酶的研究

家蚕核多角体病毒(NPV)感染的中肠组织中的DNA多聚酶,经过磷酸纤维素柱层析纯化,正常家蚕中肠与NPV感染的家蚕中肠NPV多聚酶都表现了前和后两个活力峰,感染NPV的家蚕中肠DNA多聚酶前、后峰的比活力比正常家蚕中肠DNA多聚酶前,后峰的比活力分别提高10～15倍,总活力回收为56～60％。研究了DNA多聚酶的性质,讨论了与NPV复制的关系。     

双链核糖核酸病毒的研究 Ⅲ.水稻普通矮缩病毒与家蚕细胞质多角体病毒间的免疫交叉反应

水稻普通矮缩病毒(RDV)的兔抗血清能分别与家蚕细胞质多角体病毒(CPV)颗粒及其双链RNA在免疫对流电泳中产生沉淀线。用水稻普通矮缩病毒的抗血清中和后的家蚕CPV的感染力与对照相比降低二个数量级。     

家蚕细胞质多角体病毒的研究V．多聚酶与感染活力的关系

纯的家蚕细胞质多角体病毒(以下简称cPV)含有以双链RNA为模板的RNA多聚酶。家蚕cpv经氯仿,30％乙醇,pH3．8等处理,其RNA多聚酶活力显著降低,感染能力也随之相应下降。用 Triton X—100处理家蚕CPV,其多聚酶活力提高约27％,感染活力也相应提高。这些结果说明,在病毒的复制增殖过程中,家蚕CPV所含的以双链RNA为模板的RNA多聚酶是必需的。同时,对经不同条件处理的家蚕CPV颗粒的形态进行了电镜观察。     

双链核糖核酸病毒的研究 Ⅱ.家蚕细胞质多角体病毒免疫学的研究

按前报用分子筛凝胶柱层析纯化家蚕细胞质多角体病毒(Cytoplasmic polyhedrosis virus,以下简称CPV)作为抗原制备了兔抗血清。对接种CPV后不同时间的家蚕中肠组织内CPV的增殖过程进行了观察,表明利用免疫对流电泳在CPV感染后的12～20小时(即病毒在病蚕中肠组织内增殖初期)就可检出。家蚕CPV的抗血清与其他几种昆虫的CPV有免疫交叉反应,但当家蚕CPV的抗血清经双链多聚核苷酸(肌苷酸/胞嘧啶核苷酸,即poly I/poly C)吸收后,则与其他几种昆虫CPV的交叉反应即行消失。     

陕西七纺器蛛和拉土蛛不同组织酯酶同工酶的比较研究

陕西七纺器蛛(Heptathela shaanxiensis),拉土蛛(Latouchia sp.)均于1987年10月采自陕西泾阳。在同条件下采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行了不同组织的酯酶同工酶比较。实验方法酶液的制备:将饥饿10天的两种蜘蛛按常规解剖,分别取各组织置于研钵内,根据样品重量之差异,分别加入40%蔗糖溶液1—3ml,匀浆过滤,离心(3500rpm×15′)。取上清液作酶源,贮存于4℃冰箱备用,点样时加入适量0.1%澳酚蓝作电泳的指示染料。酯酶同工酶的聚丙烯酰胺疑胶电泳分离和染色、脱色:基本参照邱琼华等(1987)的方法。用日本20M光密度计(波长570nm,狭缝0.4cm)扫描…     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

短时热激后家蚕对核型多角体病毒的抗性及相关抗菌肽和热激蛋白基因表达水平的变化

【目的】探讨短时热激对家蚕Bombyx mori抵抗核型多角体病毒能力的影响,为深入研究家蚕热激响应的抗病毒免疫机制提供参考。【方法】家蚕5龄幼虫42℃热激15 min后,经口喂食家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)(5.4×106PIBs/头)后正常饲养,观察热激对家蚕感染病毒的影响;同时,利用实时荧光定量RT-PCR技术检测热激后7类抗菌肽主基因(Bmcec D,Bmmor,Bmglve2,Bmdefe B,Bmatta1,Bmenbo2和Bmlebo3)以及6种热激蛋白基因(Bmhsp90,Bmhsp70,Bmhsp40,Bmhsp19.9,Bmhsp21.4和Bmhsp25.4)在家蚕5龄幼虫中肠组织中的表达变化;利用MEGA 5.0软件对家蚕所有热激蛋白进行系统进化分析。【结果】与未进行热激处理相比,短时42℃热激能够明显提高感染Bm NPV的家蚕5龄幼虫的存活率。实时荧光定量RT-PCR结果表明,与未热激处理相比,热激处理后感染Bm NPV的家蚕5龄幼虫中肠组织中Bmglve2和Bmhsp25.4的表达量显著上升。另外,系统进化分析显示,小分子热激蛋白Bm HSP25.4在进化上特殊,单独与大分子热激蛋白(Bm HSP90,Bm HSP70和Bm HSP40)聚为一类。【结论】短时热激能够提高家蚕对Bm NPV的抗性,热激蛋白基因Bmhsp25.4和抗菌肽基因Bmglve2可能在家蚕热激响应的抗病毒免疫中发挥关联功能。     

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体,在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的,该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ-１的多角体蛋白基因启动子下游,构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞,通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选,获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定,证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒,提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和免疫印迹分析,结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。     

家蚕核型多角体病毒结构多肽的双向电泳分析

用等电聚焦-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳的双向电泳法和银染色方法,分析了家蚕核型多角体病毒粒子和核衣壳的结构多肽。该病毒单粒包埋型病毒粒子含约96种多肽,核衣壳含约72种多肽。病毒粒子制剂和核衣壳制剂中含有较多量的分子量为31K的多肽,用蔗糖梯度离心、离心洗涤、碱处理甚至蛋白酶酶解和去污剂处理,都不能将其除去。向病毒制剂中加入纯化的多角体蛋白后作双向电泳,发现外加多角体蛋白改变原等电点面与上述31K多肽重合。对31K多肽的来源进行了讨论。     

牛血浆中一种α_1-糖蛋白的提純和鉴定

(一)本文用硫酸銨分段沉淀和DEAE纤維素柱层析方法从牛血浆中提取了一种对三氯乙酸不稳定的α_1-糖蛋白,經鉴定系超离心、电泳和免疫純。光散射法測定分子量为66,500,超离心-扩散法測定为67,000(偏微比容取0.65)。 (二)該蛋白质具有抑制胰蛋白酶的活力,酶与糖蛋白的克分子比值是2:1。 (三)該蛋白质与胰蛋白酶結合后,仍与其相应抗血清产生沉淀反应,文中对其抑制活力中心和抗原决定簇的关系作了討論。     

家蚕微孢子虫与家蚕ECH1和GAPDH蛋白的相互作用

【目的】在分子层面上研究家蚕微孢子虫Nosema bombycis与家蚕Bombyx mori蛋白的相互作用,初步探讨家蚕微孢子虫向家蚕细胞能量中心靠近的原因。【方法】采用Far-western blot分析与家蚕微孢子虫具有相互作用的家蚕中肠蛋白,质谱鉴定筛选出候选蛋白。PCR扩增候选蛋白的基因,连接到p ET30a载体并转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞培养,测序选取正确的3个重组质粒,转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中诱导表达候选蛋白,亲和层析柱纯化候选蛋白,制备多克隆抗体。用免疫共沉淀和间接免疫荧光技术验证候选蛋白与家蚕微孢子虫的相互作用。【结果】Far-western blot筛选到的anti-SWP9和anti-SWP5抗体与感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠总蛋白的PVDF膜孵育,分别在26 k D和34 k D处检测到一条特异条带,说明家蚕微孢子虫与26 k D和34 k D的家蚕中肠蛋白发生了相互作用。对质谱鉴定结果进行蛋白质的分子量、肽段数以及功能的分析,筛选出与家蚕微孢子虫相互作用的候选家蚕蛋白烯酰辅酶A水合酶(ECH1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和3-羟酰辅酶A脱氢酶(HCDH)。利用制备的能够特异识别ECH1,GAPDH和HCDH 3种蛋白的多克隆抗体anti-ECH1,anti-GAPDH和anti-HCDH进行免疫共沉淀,证实了家蚕微孢子虫与家蚕中肠蛋白ECH1和GAPDH具有相互作用;间接免疫荧光分析结果进一步说明GAPDH能与家蚕微孢子虫特异性结合。【结论】家蚕微孢子虫可以和家蚕蛋白ECH1和GAPDH特异性结合。由于ECH1是定位于线粒体膜上的脂肪酸β-氧化的关键酶,GAPDH是糖酵解途径的关键酶,推测家蚕微孢子虫可能通过和家蚕ECH1和GAPDH的相互作用,在空间上靠近宿主细胞的线粒体和糖酵解途径,便于摄取宿主细胞脂肪酸β-氧化和糖酵解途径产生的中间产物和ATP,满足家蚕微孢子虫的物质和能量需求。     

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体,并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建GAPDH/p ET-28a原核表达载体,获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白;经SDS-PAGE和抗His单抗检测,纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致;以该蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫,获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明,GAPDH抗体的效价为1:8000,并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体,为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。     

鸡贫血病毒VP1和VP2蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒vp1和vp2基因分别克隆入转移载体pBacPAK8中,获得重组转移质粒pBac-vp1和pBac-vp2。以上两质粒分别与Cvn Ⅰ酶切线性化的亲本病毒Bm\|BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞,通过蓝白斑筛选,纯化得到重组病毒Bm-vp1和Bm-vp2。PCR分析表明vp1和vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将Bm-vp1和Bm-vp2共感染5龄家蚕,通过表达产物免疫SPF鸡产生的抗血清与CAV感染的MDCCMSB1细胞的间接荧光抗体分析,证明表达产物能诱导鸡产生相应的抗体,而且能够保护子代鸡免受CAV的攻击。该研究表明,表达VP1和VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒(Recombinant BmNPV)是很有前途的CAV亚单位疫苗的生产系统。     

酶标SPA免疫酶法检测宫颈癌患者血清中单纯疱疹病毒抗体

免疫酶法用于检测病人体液中病毒特异性抗体与其它方法相比。是一种简便易行、敏感性、特异性较好的方法,应用日广。用它检测病毒IgG抗体,通常以酶标抗人IgG(简称酶标抗体)作为第二抗体。本文将辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(简称酶标SPA)用于免疫酶法中检测宫颈癌患者血清中单纯疱疹病毒     

生物技术在植物病害诊断中的应用

1 免疫技术 1.1 酶联免疫法 Voller[1]和Clark[2]等早在70年代中期就将现代血清学技术——酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)应用于植物病毒的检测.ELISA与血清学技术相比具有明显的优越性,可灵敏地大规模定量检测植物提取液中病毒蛋白的含量,这一技术现已成为植物病毒病害诊断的标准方法[3].以后,人们对ELISA技术在检测速度、表确性以及仪器装备等方面进行了改进,使之更加趋于完善.除此之外,其它一些以抗体为基础的检测技术如放射免疫检测、免疫荧光技术、免疫显微镜检技术等也用于植物病害的诊断.     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

漂白粉对家蚕中肠产消化酶细菌的影响

【目的】本研究以漂白粉液浸渍消毒(以下简称浸消)桑叶饲喂家蚕为处理组,分析了不同组之间家蚕中肠细菌数量的差异;探讨了各组家蚕中肠产消化酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶)细菌的菌株数量、产酶种类及相对产酶能力的差异。【方法】用16S rDNA测序技术对产酶菌株进行了鉴定,比较各组产酶菌种类的不同。【结果】饲喂不同有效氯浓度漂白粉液浸消叶对家蚕中肠细菌的数量、产酶菌数量均有抑制作用,且随有效氯浓度升高抑制作用增强;各处理组产蛋白酶菌株平均相对产酶能力均低于清水组,且清水组肠液中产淀粉酶菌株数明显多于各处理组;取食漂白粉液浸消桑叶后,家蚕中肠产消化酶细菌类群构成有一定变化,清水组和全程0.3%组产酶菌属相对较丰富,有Staphylococcus sp.、Lelliottiasp.和Buttiauxella sp.,其他处理组的产酶菌属相对单一,只有Staphylococcus sp.。【结论】以上结果说明漂白粉对家蚕中肠内细菌及产酶菌的增殖有抑制作用,中肠内产蛋白酶菌的产酶能力和产淀粉酶菌株的数量也受到抑制,对产酶菌类群构成有一定影响。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒