应用荧光原位杂交技术检测人β^E珠蛋白基因小鼠染色体上的整合状态

为将荧光原位杂交技术应用于基因定位研究中,探讨一种能有效地检测转基因动物染色体上外源基因整合状态的实验方法,对小鼠腹腔注射秋水仙素后,取转基因小鼠骨髓制备中期染色体,将传统的FISH方法加以改进,检测外源基因在转基因小鼠染色体上的整合状态。检测结果表明,外源人β^E珠蛋白基因已稳定地整合于小鼠染色体上,FISH能直观地反映外源基因在转基因动物染色体上的整合状态,该方法可对转基因动物及基因转移研究中的外源基因整合反进行染色体定位检测。     

睾丸注射法制备携带山羊H-FABP基因的转基因小鼠

为探究睾丸注射法制备转基因动物的可能性,文章将携带有山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和绿色荧光蛋白标签的重组载体经脂质体包裹后随机打点注射小鼠睾丸。对实验小鼠进行睾丸切片、精子荧光检测以及精子DNA检测,证实外源基因在亲代小鼠体内成功表达。睾丸注射后小鼠与正常母鼠交配产生的F1代,以及F1代自交产生的F2代在不同水平均可检测到外源基因的成功表达,阳性率分别为4%和30.23%。研究结果说明睾丸注射是一种制备转基因动物行之有效的方法,且外源基因可以稳定遗传。该方法的完善和成熟对于动物转基因以及动物性状改良和育种具有理论和实践意义。     

精子因素对精子载体法制备转基因山羊的影响

精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力,并在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物.精子介导基因转移(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一.精子因素是影响SMGT方法生产转基因动物的重要方面.本论文结合我们的研究针对转染用山羊(Capra hircus)精液的来源、精子质膜完整性、精液品质及发育阶段等精子因素影响精子结合外源DNA和SMGT方法生产转基因山羊的效率进行了论述,并从这些影响因素入手,提出了筛选精子供体、保持精液品质、调控质膜等措施,提高精子转染外源DNA能力和生产转基因动物的效率.     

氯化钠密度梯度离心法制备用于显微注射的外源DNA片段

DNA显微注射是生产转基因动物最可靠和最常使用的一种方法,外源DNA的纯度对显微注射的成功起着至关重要的作用。本文介绍用氯化钠密度梯度离心的方法制备用于显微注射的外源DNA片段。与传统的琼脂糖凝胶回收的方法相比较,用此方法制备的外源DNA片段对小鼠受精卵进行显微注射后,受卵体母鼠的胚胎存活率,以及子代小鼠的外源基因整合率均有明显的提高。这一方法可为进一步提高转基因动物的成功率,提供方法学上的参考。 Abstract:DNA microinjection is the most popular and reliable method of producing transgenic animals.The purity of foreign DNA plays an important role for the success of microinjection.In this study,we introduced the use of sodium chloride step gradients in fractionating foreign DNA fragment for microinjection.The data demonstrated that,compared with the conventional agarose gel extraction method,NaCl purification scheme of toreign DNA could improve the treated embryo survival and foreign DNA intergration rate markedly.     

利用卵胞浆精子注射（ICSI）技术生产转基因小鼠

在掌握小鼠ICSI技术的基础上,进行了ICSI技术生产转基因小鼠的研究。来自成年KM小鼠附睾尾的精子,使用未加抗冻剂的HEPES-CZB溶液,在液氮中冻融1次后,用于本实验。解冻精子与DNA混匀1min后,精子头被显微注射到B6D2F1小鼠成熟卵母细胞质中。精子头与pEGFP-N1环状DNA共注射生产的ICSI受精卵,在CZB溶液中培养至囊胚期时,39.1%(9/23)的囊胚表达GFP基因。精子注射后6h,直接移植ICSI受精卵后,7只妊娠受体一共产仔30只,效率为23.8%(30/126)。Southernblot分析其中16只小鼠发现,3只(18.8%)转基因小鼠同时整合了GFP和Neomycin基因,它们全部来自精子和线性DNA混合的实验组(阳性效率为33.3%,3/9),相反,精子与环状质粒DNA共注射生产的7只ICSI后代中,没有检测到外源基因。转基因小鼠整合的外源基因能够传递给它们后代。结果说明,利用ICSI技术可以高效地生产转基因小鼠,宿主基因组可能更容易整合线性化的外源基因。     

转基因动物研究现状

导言 1980年Gordon等人将疱疹病毒胸苷激酶基因和SV40早期基因启动子重组到质粒pBR322中,再由显微注射植入小鼠受精卵原核,获得第一只转基因小鼠。原理上任何克隆基因都能永久并入哺乳动物胚胎基因组。显微注射后,外源DNA整合进细胞,随后繁衍成种系。因此通过选育能永久建立携带一个或多个新基因的动物谱系。“转基因”(Transgenic)一词应运而生。在此之前,Jaenisch(1976)观察到逆转录病毒(又称逆病毒)感染小鼠胚胎,使单个前病毒DNA插入小鼠染色体DNA。而后含异源基因的重组感染性逆病毒系统的发展导致了用     

生产转基因动物的技术现状

用实验手段,可将特定外源基因导入早期胚胎的细胞,由此整合到染色体上,还可通过被整合动物的生殖细胞系传给子代。这类整合外源基因的“新动物”被统称为转基因动物(Transgenic Animals)。 按人为意愿设计生产转基因动物,能达到如下若干目的:1)将理想的遗传物质导入动物染色体,以扩大种内遗传变异,迴避有性繁     

转基因动物技术及其若干问题

转基因动物是用基因工程技术,将外源目的基因经由生殖细胞或早期胚胎导入动物胚胎染色体基因组内,使之稳定整合并能传给后一代的动物。被导入的外源目的基因称为转基因。经转基因操作成功的受精卵或胚胎所发育的第一代个体称为首建者。1974年Jaenisch等首次报道应用显微注射法将SV40注入鼠胚胎获得第一例嵌合型转基因小鼠。至今,转基因动物     

外源基因在转基因小鼠中遗传和表达的稳定性

通过显微注射将外源构件λ１０６（年α－Ｓ１酪蛋白基因调控区指导的乙肝病毒表面抗原基因表达构件）导入小鼠受精卵中,用ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｍ方法进行外源基因的整合检测、ＥＬＩＳＡ法进行外源基因的表达检测,对４代转基因小鼠进行了跟踪测定,结果表明：的代转基因小鼠的整合率为５６％,原代雌鼠乳汁中转基因产物的表达率为１００％;传代跟踪基因的整合率不符合“单一位点随机整合”的假说,家系分析推测外源基因在受精卵     

通过染色体外同源重组建立乳腺中表达外源基因的转基因小鼠

为研究染色体外重组方法在创建转基因动物中的应用,选取牛asl酪蛋白基因的5′及3′侧翼区和氯霉素乙酰化酶编码区,构建了两个具有3 kb相互重叠的融合基因.将这两个DNA片段末端脱磷酸后,以摩尔比1:1的比例混合,通过显微注射导入小鼠受精原核,最后获得了11个品系的转基因小鼠.对其中10个品系的小鼠的整合分析表明,所注射的两个DNA片段均发生了染色体外同源重组,而且除了 1个品系的小鼠丢失了大约1kb的序列外,其余品系小鼠的重组产物与预想的结构符合.在当代和后代的转基因小鼠乳汁中均可测到氯霉素乙酰化酶的活性.这表明融合基因在转基因小鼠乳腺中得到表达和分泌,也说明显微共注射两个相互重叠的基因片段是建立转基因动物的一个可行途径.     

TIMP-1转基因小鼠纯合子的建立及建系

采用遗传学育种方法 ,使外源基因整合位点随机的基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP 1)转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠而建立TIMP 1转基因小鼠品系 .通过受精卵原核显微注射方法 ,获得带有人TIMP 1基因的Founder小鼠 .将转基因小鼠与正常小鼠交配 ,得到子代小鼠 .通过PCR及Southern印迹等方法 ,检测TIMP 1DNA在转基因小鼠体内的整合情况 ,阳性率达5 0 %后 ,进行近亲交配 .提取小鼠组织总RNA ,Northern印迹分析阳性小鼠各组织外源性TIMP 1mRNA表达情况 ,以正常NIH小鼠做对照 .获得了 6代小鼠共 4 2 4只 ,其中PCR阳性鼠 2 72只 ,Southern阳性鼠 2 2 6只 ,纯合子转基因小鼠 12 8只 ;F4代后阳性率达到 95 %以上 .转基因小鼠TIMP 1基因表达情况在肾脏的丰度明显高于肝脏和脾脏 (P <0 0 1) ,而肝和脾之间并没有显著差异 (P>0 0 5 ) .外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传 ,并得到了整合有TIMP 1基因的纯合子转基因小鼠 ,且在阳性的转基因小鼠体内在肾脏中特异性表达 ,为以后开展TIMP 1的肾脏病理生理研究提供了有用的手段     

体内系统转基因新方法

建立了一种全新而高效的制备转基因动物新方法.无需外科手术,将含有绿色荧光蛋白的重组质粒直接多次多点反复注射到雄性ICR小鼠的睾丸内.几周后,上述雄性动物与自然发情的雌性交配,制备转基因动物.经PCR检测、DNA印迹,实验结果表明:F1代小鼠转基因阳性率为41%.经DNA印迹证明:外源基因已经整合到子代转基因动物的基因组内并能遗传给后代.将F1代阳性鼠与正常ICR鼠交配,产生F2代转基因鼠,F2代转基因阳性率37%.上述实验结果表明,建立的体内系统转基因方法简便、高效,适用于大规模制备转基因动物,特别适用于一些大型家畜.     

我国转基因动物研究概况

转基因动物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。自从80年代初美国科学家首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵雄性原核中,获得了个体比对照大一倍的转基因“超级鼠”后,转基因猪、鱼、兔和羊等相继问世,为动物基因工程育种提供了新的途径。本文仅就笔者收集到的资料对国内转基因动物的研究作一简要介绍。     

抗病毒基因与哺乳动物抗感染育种研究进展

近年来,人们利用基因工程的原理和技术分离或合成了诸如干扰素、白介素等一类细胞因子的DNA或cDNA,这类物质在抗病毒感染及免疫调节等方面都具有重要的功能;同时,人们还发现了诸如反意RNA、Ribozyme等一类小分子RNA,它们在病毒的转录及复制过程中起着重要的调控作用。将这些DNA、cDNA或RNA导入体外培养细胞,转化细胞可以获得抗病毒功能。以显微注射为主要手段的转基因动物构建技术,可以有效地将这些外源目的基因导入动物受精卵,使其整合、表达,并于某些转基因动物体内产生相应的抗感染等生物学效应,从而使动物抗感染基因工程育种的设想成为可能。     

猪生长激素基因在金鱼中的整合、表达与生物活性(英文)

自Ｐａｌｍｉｔｅｒ于１９８２年首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵,培育出“超级鼠”以来,转基因动物技术获得迅速发展。本文以低等脊锥动物为实验动物,探讨猪生长激素基因导入金鱼受精卵后的整合与表达、生物学效应及后代遗传等问题,为进一步研究外源基因在高等脊椎动物（包括猪）内整合与表达的调控机理提供方法上的参考。实验结果表明：采用显微注射方法,将羊金属硫蛋白基因启动子与猪生长激素基因重组的线型ＤＮＡ（Ｆｉｇ．１）片段导入金鱼受精卵中,获得成活实验鱼,经斑点（Ｆｉｇ．２）,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（Ｆｉｇ．３）,筛选ＰＧＨ阳性的转基因鱼作为亲本交配,分别得到Ｆ１代和Ｆ２代。经斑点、ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析（Ｆｉｇｓ．４,５＆６）及放射免疫检测（Ｔａｂ．１）,表明外源基因在部分受体鱼中得到整合和表达,并能通过有性繁殖传递给后代,且仍具生长效应（Ｆｉｇ．７;Ｔａｂ．２）。本实验获得的转基因阳性金鱼数量有限,且只传了两代,似乎不足以说明转基因金鱼后代表观特征的遗传稳定,但转基因金鱼Ｆ１代中存在外源基因整合位点纯合的个体是可能的。这为建立转基因动物纯系奠定了基础。     

人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。     

显微注射外源DNA在早期胚胎中的命运

应用显微注射法制备转基因动物时,外源DNA早期在胚胎的命运比较复杂,但对一些基本问题已有所了解。外源DNA在早期胚胎中发生着一系列的事件:染色体外重组,最终以线性DNA的形式整合入宿主基因组内;不同的细胞周期进行的微注射决定整合的频率及嵌合的比例,整合事件发生于第一个细胞周期S期,大多数呈现非嵌合现象。     

Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。     

小鼠输精管内转染法建立人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺定位表达生物反应器的研究

外源基因受精卵内显微注射目前仍然是种常用的建立转基因动物的方法,但此方法操作复杂,成本高。因此利用精子作为载体将外源基因带入卵细胞内建立转基因动物成了极具吸引力的方法,并且已有一些成功的报道。虽然该方法简单,但总体来说可重复性较差。我们在建立乳腺定位表达人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)小鼠模型中,对此方法做了改进,即将脂质体包裹的外源基因在小鼠输精管及附睾管内转染精子,而非以往的在体外转染,结果:(1)五只转染小鼠,术后10天内共使10只正常母鼠受精;(2)共繁殖出79只首建者小鼠,存活42只;(3)用PCR检测首建者小鼠外源基因的整合,阳性率为7/42(16.67%);(4)用凝胶平板溶圈试验检测5只PCR阳性的雌性首建者小鼠泌乳期乳汁中的活性tPA,3/5表达,表达量在12—20IU/ml之间(约相当于48—80ng/ml);(5)PCR检测4只子一代小鼠外源基因的遗传情况,阳性率为2/4。     

嵌合基因δKρF在转基因小鼠内的组织特异性表达

本文报告了鸡δ晶体蛋白基因的启动子,被Friend脾病灶形成病毒(SFFV)的长末端重复顺序(LTR)取代后的嵌合基因δKpF在转基因小鼠内的表达特性。采用显微注射方法,将含有δKpF基因的重组质粒pδKpF DNA导入小鼠受精卵的雄原核,再将其植入假孕小鼠的输卵管内,经生长发育,产出小鼠35只。以DNA-DNA分子杂交分析,发现其中1只小鼠的基因组DNA中整合有所导入的δKpE基因。再以免疫酶标记方法检测,发现δKpF基因在转基因小鼠内能够表达,而且具有组织特异性。作者认为,与δ晶体蛋白基因组织特异性表达有关的调节顺序位于+677bp之后。这与Hayashi等(1985)以培养细胞研究的结论不一致。