白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用

目的建立测定吸附无细胞百白破联合疫苗中白喉类毒素酶联免疫检测(ELISA)方法,并进行验证及初步应用。方法以高效价兔抗DT多克隆抗体和相应酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法,确定线性范围同时验证该方法的重复性和特异性等确定检测限度,并初步应用。结果 DT含量在0~0.0160 Lf/m L范围内反应曲线线性关系良好(r0.99)。该方法与破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)、百日咳毒素(Pertussis toxin,PT)、百日咳丝状血凝素(Filamantous hemagglutinin,FHA)与黏着素(Pertactin,Prn)无明显交叉反应,重复性好、特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,通过验证确定的准确检测范围为0.000 8~0.016 0 Lf/m L;检测限度为0.000 8 Lf/m L。该方法对DT抗原进行了吸附率的检测,同时检测了10批白喉类毒素原液与《中华人民共和国药典》三部2010年版规定的絮状单位检测方法进行对比,变异系数低于20%。结论建立了白喉类毒素双抗体夹心ELISA检测方法,为吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中白喉类毒素含量的质量控制提供了有效技术手段。     

百日咳菌毛抗原检测方法的建立及初步应用

目的建立百日咳菌毛(fimbriae, Fim)抗原组分纯化过程中含量监测的双抗体夹心ELISA方法。方法 Fim抗原免疫家兔获得多克隆抗血清,经辛酸-硫酸铵法纯化并用辣根过氧化物酶标记,采用棋盘滴定法确定最佳包被抗体浓度和酶标抗体最适稀释倍数,建立双抗体夹心ELISA检测法,并对其进行全面验证。结果棋盘滴定法确定包被抗体浓度为2μg/mL,最适酶标记抗体稀释倍数为2 000倍。验证双抗体夹心ELISA线性检测范围为15.625～250.000 ng/mL(相关系数r0.99)。该方法与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒抗原、白喉类毒素(diphtheria toxin, DT)、破伤风类毒素(tetanus toxin, TT)、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖(Hib)、百日咳毒素(pertussis toxin, PT)、百日咳丝状血凝素(filamentous haemagglutinin, FHA)和百日咳黏着素(pertactin, PRN)抗原均无明显交叉反应,重复性好,专属性强,其他均符合常规质控要求。结论建立了Fim双抗体夹心ELISA检测法,为百日咳菌毛蛋白生产过程和以组分百日咳疫苗为基础的联合疫苗中Fim含量的质量控制提供有效技术手段。     

百日咳丝状血凝素酶联免疫检测法的建立

目的建立百日咳组分疫苗丝状血凝素(FHA)抗原含量监控的ELISA检测法。方法制备的多克隆抗血清,经辛酸硫酸铵法纯化抗体,用过碘酸钠氧化法辣根过氧化物酶标记,以棋盘滴定法确定最佳包被抗体及酶标抗体的浓度配伍,建立了双抗体夹心ELISA检测法。结果对双抗体夹心ELISA法的特异性、最佳线性范围、检测限度、精密度、准确度、测定限量、适用性的一系列验证试验表明,该方法与百日咳组分疫苗中PT和Prn无明显交叉反应,特异性较好。在0至20 ng/mL测量区间有最佳线性,相关系数大于0.99;经实验内12次及不同试验间3次测定16、8、4 ng/mL中的FHA含量,变异系数在0.2%～11.4%间,回收率在96.9%～114.5%间,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,因此测定限量为4 ng/mL。结论该方法能有效检测出百日咳杆菌培养上清中的FHA含量,可用于百日咳组分疫苗生产过程的中间品质量控制。     

鼠疫耶尔森菌rV抗原单抗系统及其ELISA检测方法的建立

目的建立ELISA双抗体夹心法,测定重组毒力因子rV抗原含量。方法采用杂交瘤技术,制备鼠疫菌rV抗原的鼠单克隆抗体,对抗原表位和单抗特异性进行分析及鉴定,建立ELISA双抗体夹心法,并验证方法的专属性、准确性、精密度和线性范围。结果成功组建了鼠疫菌rV抗原诊断试剂,灵敏度最低检测值为10 ng/mL。结论该方法可用于免疫学检测鼠疫组分疫苗原液rV抗原含量及制备过程中抗原活性,是鼠疫组分疫苗制备中一种重要的质量控制手段,也为进一步开发鼠疫诊断试剂盒及其他相关研究奠定了基础。     

肠道病毒71型灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法的建立及应用

目的 建立肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV-A71)灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法并对其进行方法学验证及初步应用。方法 以抗EV-A71兔多克隆抗体为包被抗体，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的抗EV-A71鼠单克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA并验证其线性范围、专属性、准确度、精密度及耐用性等。通过检测EV-A71疫苗原液及研发生产工艺各中间制品的EV-A71抗原含量评价该方法的适用性。结果 包被抗体与酶标抗体最佳稀释度分别为1∶5 000和1∶10 000。抗原为5～80 U/mL时，线性良好；与同为肠道病毒的其他抗原不存在交叉反应，专属性良好；对不同浓度抗原进行6次测定，其回收率在90%～100%,准确度良好；不同实验员对不同浓度抗原样品检测3次，CV均<11%,精密度良好；针对不同影响因素设计耐用性试验，回收率均在80%～120%,耐用性良好。该方法检测EV-A71疫苗原液和制备过程中的中间制品均具有良好的线性和平行性，表明该方法具有良好的适用性。结论 建立了EV-A71疫苗(Ve...     

重组人睫状神经营养因子蛋白质定量检测方法的建立

采用ELISA双抗体夹心法,建立一种快速灵敏的定量检测rhCNTF成品蛋白含量的方法。结果显示,rhC-NTF抗原浓度在(0～25)ng范围内线性良好(r>0.99),灵敏度为0.3ng/ml,与其他重组细胞因子无交叉反应,样品的检测结果与理论含量相吻合,CV<15%,该方法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好。     

破伤风类毒素抗体酶联双抗原夹心法定量检测试剂的研制及评价

研制破伤风类毒素抗体酶联双抗原夹心法定量检测试剂,用于破伤风免疫血浆抗体效价检测。以精制破伤风类毒素经Sephacryl S-300柱层析纯化后作为包被抗原,用辣根过氧化物酶以改良过碘酸钠法标记精制破伤风类毒素作为酶标记抗原,以破伤风人免疫球蛋白国家标准品采用小鼠中和试验法标定试剂盒定量标准品,制备双抗原夹心法定量检测试剂;进行试剂盒检测范围、特异性、重复性、精密度及稳定性考核,并与小鼠中和试验法、琼脂双扩散法及国外破伤风类毒素抗体酶联试剂盒进行比较。结果显示,试剂盒的检测范围为10~150mIU/ml,灵敏度为10mIU/ml,线性好(r>0.996),板内孔间变异度小(CV<8%),特异性强(100%),重复性好(CV<13%),于37℃放置6天测定结果无明显差异,与小鼠中和试验法、英国Biding Site酶联试剂有良好的一致性。试验证明所研制的试剂盒适用于破伤风免疫血浆中的破伤风抗体效价定量检测。     

双抗体夹心ELISA检测HIV-1 gp41抗原方法的建立

目的:建立检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA,并探讨其临床应用的可行性。方法:用饱和硫酸铵(SAS)纯化抗HIV-1gp41-5单克隆抗体(mAb),用HRP标记后建立双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测,并用该方法对40份HIV-1阳性血清进行了检测。结果:用mAbE12(5μg/mL)为包被抗体,2H6为酶标记抗体(1∶900)建立了双抗体夹心ELISA法,检测gp41-5多肽的灵敏度是100pg/mL。对HIV-1阳性血清中gp41抗原的检出率为67.5%(27/40)。结论:建立了特异性强、灵敏度良好的检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。     

两种甲型肝炎病毒抗原快速检测方法的建立

目的建立两种甲型肝炎病毒抗原(HAV-Ag)检测试剂盒,并对其检测效果进行评价。方法生物素标记甲型肝炎病毒抗体(HAV-Ab)与辣根过氧化物酶标记亲和素联合应用建立甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法;同时使用辣根过氧化物酶标记HAV-Ab作放大系统建立双抗体夹心甲型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂,对比两种检测方法的特异性、灵敏度及实际应用效果。结果用生物素标记甲型肝炎病毒抗体-辣根过氧化物酶标记亲和素作放大系统建立的甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法,较双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度高1～2个稀释度;两种检测法均对10余种病毒无交叉,P/N值BA-ELISA检测法较高。结论甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法是一种灵敏度高,特异性好,方便快捷的检测方法,可广泛应用于甲型肝炎病毒研究及临床检测中。而甲型肝炎病毒抗原双抗体夹心ELISA检测法,检测灵敏度适中,操作简单,更适用于甲肝疫苗生产检定。     

百日咳、白喉、破伤风、乙型肝炎联合疫苗的实验研究

对制备无细胞百日咳菌苗、白喉、破伤风、乙型肝炎联合疫苗的实验室条件进行了初步探索,实验结果表明,联合疫苗的配方以每毫升无细胞百日咳组分１５－１８μｇ．ＰＮ、白喉类毒素３０ｌｆ、破伤风类毒素７－１０ｌｆ和基因工程乙肝表面抗原２０μｇ为宜,稀释缓冲液选用０．８５％ＮａＣｌ溶液吸附效果较好,动物实验证明联合疫苗中各组分均安全有效。     

四种丙型肝炎病毒抗体试剂检测方法的性能评估

对血液筛查的四种丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)抗体试剂检测方法的性能进行评估。方法采用协作标定方式,应用四种检测方法(间接ELISA法、双抗原夹心ELISA法、间接CLIA法、双抗原夹心CLIA法)16种HCV抗体试剂,对经确证筛选出的70份(HCV抗体阳性35份、阴性35份)血浆样本进行检测,通过分析阳性、阴性符合率,评估四种方法 HCV抗体试剂的性能。结果间接ELISA法试剂检测阳性符合率为88.6%(31/35)~94.3%(33/35),双抗原夹心ELISA法、间接CLIA法、双抗原夹心CLIA法试剂检测阳性符合率为91.4%(32/35)~94.3%(33/35),四种检测方法 HCV抗体试剂阳性符合率之间的差异无统计学意义(P0.05);间接ELISA法和间接CLIA法试剂弱阳性样本检出率为11.4%(4/35)~31.4%(11/35),双抗原夹心ELISA法和双抗原夹心CLIA法试剂弱阳性样本检出率为5.7%(2/35)~11.4%(4/35),四种检测方法 HCV抗体试剂对弱阳性样本的检出率之间的差异有统计学意义(P0.05);间接ELISA法试剂检测阴性符合率分别为94.3%(33/35)~100%(35/35),间接CLIA法试剂阴性符合率分别为94.3%(33/35)~97.1%(34/35),双抗原夹心ELISA法和双抗原夹心CLIA法试剂阴性符合率均为97.1%(34/35),四种检测方法 HCV抗体试剂阴性符合率之间的差异无统计学意义(P0.05)。结论四种检测方法 HCV抗体试剂的性能基本一致,不同方法各有优缺点,建议应用多种检测方法对弱阳性样本进行确认检测。     

汉滩病毒PS-6单克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

目的 制备汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)PS-6株小鼠单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb),建立HTNV抗原双抗体夹心ELISA检测方法,验证方法的检测性能并初步应用于疫苗抗原含量检测。方法 以HTNV PS-6株灭活全病毒原液作为免疫原,采用小鼠杂交瘤融合技术,筛选mAb杂交瘤细胞株,制备mAb;用间接ELISA测定mAb效价;用Western blot鉴定mAb特异性;用间接ELISA测定mAb相对亲和力;经抗体配对筛选,建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以I型肾综合征出血热疫苗标准品作为定量标准,验证该方法的检测限、线性范围、特异性、准确度、精密度;对6批次I型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行检测,初步验证该方法的适用性。结果 获得4株稳定分泌抗HTNV PS-6特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株：4B2、3H8、5D7及2A7;间接ELISA检测腹水抗体效价均在1×10⁶～1×106～1×10⁷;Western blot鉴定4株mAb均能特异性识别HTNV PS-6;相对亲和力为4B2>5D7>3H8>2A7;抗体ELISA配对筛选后,选用5D7作为包被抗体,4B2作为标记抗体,包被抗体工作浓度为10μg/mL,HRP标记抗体工作浓度为1∶5 000。该方法对HTNV PS-6抗原检测限为0.039 1μg/mL;检测线性范围为0.078 1～2.500 0μg/mL,R7;Western blot鉴定4株mAb均能特异性识别HTNV PS-6;相对亲和力为4B2>5D7>3H8>2A7;抗体ELISA配对筛选后,选用5D7作为包被抗体,4B2作为标记抗体,包被抗体工作浓度为10μg/mL,HRP标记抗体工作浓度为1∶5 000。该方法对HTNV PS-6抗原检测限为0.039 1μg/mL;检测线性范围为0.078 1～2.500 0μg/mL,R²> 0.97;检测与I型肾综合征出血热疫苗生产主要原辅料成分、II型肾综合征出血热疫苗、森林脑炎疫苗及甲肝疫苗均无交叉反应;准确度验证,病毒抗原回收率在95.8%～110.5%之间;试验内和试验间精密度,CV分别在6.72%～8.03%、8.24%～9.70%之间。用该方法检测6批次I型肾综合征出血热灭活疫苗原液,结果均呈剂量依赖性。结论 成功制备HTNV PS-6株mAb,建立病毒抗原双抗体夹心ELISA抗原检测方法,方法准确、可靠,可初步应用于I型肾综合征出血热灭活疫苗科研、生产过程病毒抗原检测。     

静注人免疫球蛋白(pH4)中抗-HBs效价双抗原夹心ELISA的验证

目的用双抗原夹心ELISA检测静注人免疫球蛋白(p H4)(human immunoglobulin for intravenous injection,IVIG)中抗-乙型肝炎病毒表面抗体(HBs)效价并进行方法验证。方法依据2003年版《药品生产验证指南》,对用双抗原夹心ELISA进行专属性、重复性、中间精密度、线性、准确度、范围、耐用性的验证;并与放射免疫方法测定抗-HBs效价的结果进行比对。结果专属性验证中,6次独立试验的回收率在83.7%~101.1%区间内;重复性试验中10、40、80、160 IU/L 4个浓度的3次重复检测结果的RSD均<20%;中间精密度验证结果显示,两位分析人员不同时间各测定6次,检测结果的RSD=5.2%,均<20%。F检验显示,人员和时间两因素在α=0.05水平上对检测结果均无统计学意义(P=0.41>0.05,F=2.19);线性验证中,抗-HBs免疫球蛋白国家标准品和IVIG成品各重复3次的相关系数r分别为0.984 3、0.990 7、0.982 2、0.991 7、0.988 3、0.992 5,均>0.980 0;在准确度验证中,3次重复检测结果的回收率为84.10%~114.10%;耐用性结果显示,在试验加入终止液后0、3、6、9、12 min的测定结果均与0 min无统计学意义(Dunnett t test,α=0.05,P>0.05,t(3)=1.350.05,t=2.27)。结论经验证,用双抗原夹心ELISA检测IVIG中抗-HBs效价,其专属性、重复性、中间精密度、线性、准确性、范围和耐用性均符合要求,该方法准确可靠、简便快速,可替代放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)用于IVIG中抗-HBs效价的测定。     

抗百日咳毒素单克隆抗体及其应用研究进展

疫苗是预防百日咳(pertussis)的最有效措施,但无细胞百日咳疫苗接种后免疫力的迅速衰退是近年来百日咳发病率上升的原因之一。百日咳毒素(pertussis toxin, PT)是由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)分泌的主要毒力因子,具有多种生物学活性。在无细胞百日咳疫苗设计初期,为确保疫苗的有效性,抗PT的单克隆抗体(单抗)常被用来检测PT表面重要的抗原表位。研究表明,与天然PT特异性结合的部分单抗无法识别经化学方法脱毒后的PT,提示化学脱毒会改变疫苗中PT的一些抗原表位,进而影响疫苗保护效果。现结合单抗可用来研究抗体干扰PT功能的分子机制,对机体在感染百日咳后的保护性免疫机制进行综述,以期为无细胞百日咳疫苗的进一步改进及开发人源化抗PT单抗治疗百日咳提供科学依据。     

新型冠状病毒S蛋白抗体制备及双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

由SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)引起的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)自2019年底暴发以来,已导致上亿人次感染和数百万人死亡,严重威胁着全人类的生命健康。为了建立一种能快速对新冠病毒疫苗中S蛋白抗原进行定量检测的方法,本研究通过免疫山羊制备多克隆抗体作为包被抗体,通过杂交瘤细胞技术制备了S蛋白特异性单克隆抗体并作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法,并验证其线性范围、敏感性、特异性、稳定性及符合率。结果显示,建立的双抗体夹心ELISA检测方法线性范围为1U~64U,相关系数R²大于0.99;特异性良好,敏感性为92.1%;批内和批间变异系数分别为2.5%~11.7%和1.3%~14.8%,检测已知背景样本符合率为96.7%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高、且稳定性和准确性高,可用于新冠疫苗中S蛋白抗原含量测定。     

结核分枝杆菌抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的:建立2种结核分枝杆菌(Mtb)抗体的双抗原夹心ELISA检测方法,并初步评价其在Mtb血清学临床辅助诊断中的应用价值。方法:采用Mtb融合抗原38k D+ESAT6+CFP10作为包被抗原,分别以辣根过氧化物酶(HRP)和生物素(Bio)标记的38k D+ESAT6+CFP10作为标记抗原,建立2种Mtb双抗原夹心ELISA法,即HRP-ELISA法和Bio-ELISA法;采用所建立的2种方法对结核患者和健康对照血清进行检测。结果:经过一系列的反应条件优化,确定HRP-ELISA法和Bio-ELISA法的最佳抗原包被浓度分别为2、0.25μg/m L,最适加样量均为100μL血清原液,最佳标记抗原稀释率分别为1∶500、1∶2000,检测的灵敏度分别为43.66%、52.11%,特异性均为100%。结论:建立了2种Mtb双抗原夹心ELISA法,它们均适用于Mtb血清学的临床辅助诊断。     

MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备

目的:制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为建立高灵敏度的Tg检测方法做准备。方法:以天然人源甲状腺球蛋白为抗原经皮下免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体,并对其进行特异性鉴定,建立检测Tg的双抗体ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)夹心法。结果:获得7株可稳定分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与Tg抗原有良好的特异性反应。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1 ng/mL。结论:成功制备了抗人Tg单克隆抗体并建立了检测人Tg双抗体夹心ELISA方法,为进一步研发Tg快速诊断试剂盒提供了原料。     

百日咳丝状血凝素的纯化及初步鉴定

目的从百日咳鲍特菌中提纯百日咳丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA),并对其进行初步鉴定。方法采用珍珠岩吸附层析和羟基磷灰石吸附层析相结合的方法,从百日咳鲍特菌培养上清中纯化FHA;SDSPAGE电泳和PAGE电泳分析样品纯度,并经斑点免疫印迹法对其进行鉴定。结果纯化样品的纯度达到95%以上,斑点免疫印迹中和FHA单抗有反应斑点,与百日咳毒素(pertussis toxin,PT)单抗无反应斑点。结论珍珠岩吸附层析和羟基磷灰石吸附层析相结合的方法可作为一种快速有效的纯化手段提取纯度较高的FHA,有望作为参考品用于百日咳FHA抗原含量检测、抗FHA血清抗体滴度检测及抗原纯度检测。     

应用病毒感染细胞酶联免疫吸附试验检测肾综合征出血热病毒抗原和抗体

应用病毒感染细胞酶联免疫吸附试验(VIC-ELISA)检测肾综合征出血热病毒(HFRSV)感染性滴度比双抗体间接ELISA和间接免疫荧光法(IFA)分别敏感10倍和100倍。VIC-ELISA检测兔抗HFRSV抗体的滴度比双抗体间接夹心ELISA和IFA分别敏感1.6倍和8倍。VIC-ELISA能敏感、快速、有效地检测HFRSV抗原和抗体。