人副流感病毒3型HN蛋白十一肽重复序列保守氨基酸突变分析

为确定人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,hPIV3)病毒包膜表面血凝素神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)糖蛋白茎部区十一肽重复序列中保守氨基酸中具有关键性作用的位点,进一步探讨HN蛋白茎部区在融合机制中的重要作用。结合定点突变和同源重组技术将HN蛋白茎部区十一肽重复序列中5个保守氨基酸位点(I102、P111、L114、S119、I125)突变为丙氨酸(Alanine,A),通过痘苗病毒-T7聚合酶系统在BHK-21细胞中表达突变蛋白,定性定量检测各突变体蛋白的促细胞融合活性、受体结合活性、神经氨酸酶活性和半融合活性。突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的促细胞融合活性均有不同程度下降,依次为野生型的6%、16%、14%、87%和4%,除S119A外其余4个突变型与野生型相比差别均具有统计学意义(P0.01);突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的受体结合活性也出现不同程度下降,依次分别为野生型的32.2%、77.4%、74.2%、83.9%和38.7%,其中I102A和I125A的受体结合活性与野生型相比差别具有统计学意义(P0.01);突变体蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的神经氨酸酶活性分别为野生型的66.5%、73.1%、69.1%、76.1%和72.8%,与野生型相比差别无统计学意义(P0.05)。结果表明:茎部区十一肽重复序列对hPIV3HN蛋白的促细胞融合活性和受体结合活性具有重要意义。该区域氨基酸I102、P111、L114、I125具有关键作用,推测其能通过影响头部区受体结合活性或是与融合蛋白的相互作用等不同方式导致HN蛋白结构功能发生改变。     

副粘病毒F1蛋白胞外非保守区对其特异性膜融合的影响

为了解融合蛋白F1分子的胞外非保守区在融合蛋白(F)与血凝素．神经氨酸酶(HN)的特异性膜融合中的作用,采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F1与人副流感病毒(hPIV)F1基因的胞外非保守区进行定点突变,创造酶切位点,得到分别含3个相同酶切位点的突变株NDV-M和hPIV-M。经检测,突变体的细胞融合功能与野毒株相同。然后用3个限制性内切酶分别从NDV-M与hPIV-M中切出两个片段NDVF-1、F-2及hPIVF-1、F-2。NDV-M和hPIV-M相互交换对应的F-1片段后进行基因重组,得到2个嵌合体(Chimera),即NDV-C1和hPIV-C1;同样方法交换F-2片段后又得到2个嵌合体NDV-C2和hPIV-C2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果表明,突变体：NDV-M和hPIV-M的细胞融合功能与野毒株相同,可用于构建嵌合体。NDV-1C和NDV—C2分别与NDV HN共表达后,融合功能达到野毒株的76．34％和96．2％,与hPIV HN共表达后均无细胞融合发生;hPIV-C1和hPIV—C2分别与hPIV HN共表达后,融合功能达到野毒株的65．82％和93．78％,与NDV HN共表达后无细胞融合发生。FACS分析表明,突变体及所有嵌合体蛋白F的表达效率与野毒株相比均没有明显变化。实验结果说明在F1蛋白的胞外非保守区中,NDV F-1和hPIV F-1这两个片段对于NDV和hPIV的特异性膜融合具有重要作用;而NDV F-2和hPIV F-2这两个片段对于NDV和hPIV的膜融合来讲,则特异性较低。     

新城疫病毒HN蛋白促细胞融合机制研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)可导致急性和高度致死性禽类传染病,严重危害世界养禽业。膜融合是NDV发挥毒力的第一步,血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)发挥促细胞融合作用,协助融合蛋白(Fusion protein,F)介导完成膜融合这一过程。本文从HN蛋白的结构和功能入手,对HN蛋白头部、头-颈连接区及颈部在促细胞融合机制中的作用进行综述与讨论,以期为深入研究NDV的致病机制,进一步研发新型药物和疫苗提供新的思路。     

人副流感病毒3型HN糖蛋白N-糖链的功能研究

为了研究人副流感病毒3型(hPIV3)HN糖蛋白N-糖链的功能,采用基因定点突变技术构建糖基化位点突变体,然后检测各突变株的蛋白电泳速率、细胞表面表达量、受体结合活性、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性。HN分子的G1、G2、G3和G4 4个糖基化位点分别和联合突变后发现G1、G2和G4及其联合突变株(G12、G14、G24和G124)电泳速率加快,而G3突变株电泳速率没有变化。各突变株的表达效率,神经氨酸酶活性与野毒株相比差别无统计学意义(P>0.05),但受体结合活性和促细胞融合活性均有不同程度的降低(P<0.05)。G1、G2和G4位点突变后受体结合活性分别为突变前的83.94%、76.45%和55.32%,而促细胞融合活性降为突变前的80.84%、77.83%和64.16%。联合突变株G12、G14、G24和G124血吸附活性进一步降低,为突变前的33.07%、20.67%、19.96%和15.11%,促细胞融合活性进一步降低为突变前的46.36%、12.04%、13.43%和4.05%。结果表明:hPIV3HN糖蛋白的糖链对HN糖蛋白的受体结合活性和促细胞融合活性有重要影响,推断糖链的丢失可能会引起HN糖蛋白头部结构(受体结合活性位点所在区域)或者方向的改变或者无法与宿主细胞膜表面的凝集素受体(一种与N-糖链结合的受体)结合,进而导致受体结合活性和促细胞融合活性的降低。     

副流感病毒5包膜糖蛋白的结构与功能

副流感病毒5(Parainfluenza virus 5,PIV5)属于单股负链不分节段的RNA病毒,迄今尚未发现PIV5与人类已知的疾病有关,主要被用作疫苗载体。其包膜上存在三种糖蛋白:融合(Fusion,F)蛋白、血凝素-神经氨酸酶(Hemaggulatinin-neuraminidase,HN)蛋白、小疏水性(Small hydrophobic,SH)蛋白。F蛋白能在同源性HN蛋白的协助下介导膜融合,HN蛋白具有受体识别、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性,SH蛋白则在病毒致病机制中起作用。本文主要阐述了三种包膜糖蛋白的结构和功能,旨在为PIV5的研究提供一些参考。     

白色念珠菌CYP51蛋白功能性氨基酸残基定点突变、蛋白表达及活性测定

实验设计了白色念珠菌CYP51蛋白功能性氨基酸残基突变体Y118A、Y118F、Y118T、S378A、S378T、H310A、H310R, 并转入基因工程菌D12667中表达。用Western及紫外分光光度法定性、定量检测蛋白, 用GC-MS法测定蛋白代谢活性。结果表明, 成功表达目标蛋白, 蛋白诱导表达量接近微粒体蛋白总量的25%。活性测定表明, 表达的野生型蛋白保持其对天然底物的代谢能力; 相较于野生型蛋白, 突变体蛋白代谢活性不同程度改变, 最多可下降1/2左右。因此, 本研究中成功表达了野生型和     

糖化作用对新城疫病毒HN糖蛋白功能的影响

为了研究糖化作用对新城疫病毒(NDV)HN糖蛋白生物学活性的影响,特别是对HN促细胞融合作用的影响,采用基因定点突变技术分别去掉HN分子上的4个糖化位点,然后检测各突变株的细胞表面表达情况、受体识别特性、神经氨酸酶活性、促细胞融合作用、免疫沉淀特性等.结果表明,将野毒株NDV HN的细胞表面表达效率定为100%时,D198R-HN突变株的表达效率为82.6%;而对二者的G1、G2、G3和G4 4个糖化位点分别进行定点突变时,得到8种突变株.它们的表达效率均有不同程度的降低,D198R-HN-G2和D198R-HN-G4两种突变株与D198R-HN相比更为明显.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变株的受体识别活性分别为突变前的47.95%、68.49%、42.67%和41.10%;而D198R-HN突变株的G1、G3和G4突变株的受体识别活性突变前后变化不明显,只有D198R-HN-G2突变株的受体识别活性得以恢复较多,从原来的10.96%恢复到32.88%.野毒株HN突变后神经氨酸酶活性普遍降低,尤以G4影响明显,仅为野毒株的9.60%;而D198R-HN突变株突变后神经氨酸酶活性普遍升高,尤以G2恢复最高,由原来的0.45%恢复到7.59%.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变前后细胞融合情况变化不大;而D198R-HN的G1、G2、G3和G4突变后,D198R-HN-G1、D198R-HN-G3、D198R-HN-G4没有变化,但D198R-HN-G2使D198R-HN的细胞融合活性得以恢复30.90%.野毒株HN电泳时呈现1条较宽的泳带,当突变掉1个糖化位点时,泳动速度加快.D198R-HN突变株及D198R-HN-G1、D198R-HN-G3和D198R-HN-G4 HN突变株电泳时,呈现两条模糊不清的条带.但D198R-HN-G2突变株HN电泳时,其条带变得窄而锐利,且泳动速度快.上述结果说明糖链能影响HN的表达或从细胞浆运输到细胞表面,G2对HN的受体识别活性影响较大,推测G2糖链部分结构的改变影响到了HN G2周围的表型特性,从而导致神经氨酸酶活性、促细胞融合作用的改变.     

核苷二磷酸激酶A的定点突变及C4S突变体的制备和活性研究

目的:对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)二硫键异构的关键残基C4进行定点突变,构建、表达并纯化C4S突变体,测定其磷酸转移酶活性和DNase活性,研究二硫键异构对NDPK-A活性的影响。方法:以pBV220-nm23-H1质粒作为模板,通过设计合适的引物对NDPK-A进行定点突变,将第4位半胱氨酸突变为丝氨酸,构建NDPK-AC4S突变体;在大肠杆菌BL21中表达,DEAE-sepharose Fas tFlow与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B纯化目的蛋白,获得均一重组蛋白,纯度达到98%;DNA序列测定及重组蛋白的肽质量指纹图谱(PMF)分析均证明构建正确突变体;高效液相色谱法(HPLC)与DNA消化法分别测定野生型NDPK-A与C4S突变体的磷酸转移酶活性与DNase活性差异。结果:NDPK-AC4S突变体的磷酸基转移酶与DNase酶活性均高于野生型NDPK-A。结论:NDPK-A缺失二硫键后,活性增高。NDPK-A形成链内二硫键可能是其活性负调控模式之一。     

人载脂蛋白A-Ⅰ半胱氨酸突变体的二级结构和脂质结合能力的比较

为探讨人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ,apolipoproteinA-Ⅰ)α螺旋不同位点的半胱氨酸突变后,对蛋白二级结构和脂质结合能力的影响,利用定点诱变技术构建apoA-Ⅰ的天然半胱氨酸突变体apoA-ⅠMilano(R173C),及其它α螺旋片段上的半胱氨酸突变体,分别为apoA-Ⅰ(S52C),apoA-Ⅰ(N74C),apoA-Ⅰ(L107C),apoA-Ⅰ(K129C),和apoA-Ⅰ(L195C).观察比较各种野生型及突变apoA-Ⅰ单体蛋白的α螺旋含量和二级结构稳定性及其脂质结合能力.结果显示,野生型apoA-Ⅰ,apoA-Ⅰ(S52C),apoA-Ⅰ(N74C),apoA-Ⅰ(L107C),apoA-Ⅰ(K129C),apoA-ⅠMilano和apoA-Ⅰ(L195C)的α螺旋含量分别为54±4%,49±4%,50±2%,51±6%,56±4%,52±3%,和54±1%,各种蛋白的α螺旋含量无显著性差异(P>0.05).野生型apoA-Ⅰ的变性标准自由能(ΔG0D)为10.5kJ/mol;apoA-Ⅰ(S52C)和apoA-ⅠMilano的ΔG0D比野生型低2.1kJ/mol;而apoA-Ⅰ(K129C)的ΔG0D比野生型apoA-Ⅰ高1.6kJ/mol.与野生型apoA-Ⅰ相比,apoA-Ⅰ(K129C)和apoA-Ⅰ(L195C)两个突变体与脂质结合能力明显下降(P<0.05),而其它半胱氨酸突变体(包括apoA-ⅠMilano)在脂质结合动力学方面与野生型apoA-Ⅰ无明显差异.以上结果提示,不同位点发生的半胱氨酸突变对apoA-Ⅰ单体蛋白的α螺旋含量无明显影响,但对蛋白的二级结构稳定性和脂质结合能力影响不尽相同.     

氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响

对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原条件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A(PBV-NDPK-A)及4种突变型NDPK-A基因(PBV-NDPK-A C4S,PBV-NDPK-A C109S,PBV-NDPK-A C145S,PBV-NDPK-A C4/109/145S)在大肠杆菌中高效表达;以DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B亲和层析技术纯化目的蛋白;HPLC法测定比较野生型NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性。结果显示,NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达;经纯化分别获得了均一的NDPK-A蛋白及突变体蛋白,纯度均达到98%;在还原环境下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性,但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响,提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态,从而影响蛋白的磷酸转移酶活性,并且NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。     

人凋亡相关基因TFAR19缺失突变体的原核表达、产物纯化及鉴定

构建TF 1细胞凋亡相关基因 19(TF 1cellapoptosisrelatedgene 19,TFAR19)缺失突变体的原核表达载体 ,获取缺失突变体蛋白 ,用于TFAR19促凋亡分子机理的研究 .从真核表达载体pcDI TFAR19扩增出野生型TFAR19和 4个缺失突变体 ,重组到原核表达载体pGEX 4T 2 .经亲和层析方法对缺失体蛋白进行纯化后 ,再利用凝胶过滤的方法进一步纯化 .利用抗GST和抗TFAR19的单克隆抗体对蛋白进行免疫学鉴定 .用白血病细胞株HL 6 0检测蛋白活性 .成功地克隆并重组了野生型TFAR19及缺失突变体 pGEX 4T 2表达载体 ,对融合蛋白的表达条件进行了优化 .SDS PAGE结果显示 ,各个缺失突变体融合蛋白均有较高水平的表达 .免疫学检测证实获得了正确的表达产物 .活性检测证实 ,野生型TFAR19和缺失突变体 4可以明显促进去血清诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,第 6外显子可能是一个与TFAR19促凋亡活性密切相关的功能结构域     

非特异性脂质转移蛋白突变体的构建及在两种硫氧还蛋白表达载体中的表达比较

对水稻非特异性脂质转移蛋白(Nospecific lipid transfer protein,nsLTP) LTP110中结构重要的5个氨基酸位点进行了定点突变,测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达。将编码野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A,D45A,C50A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较：pTrxFus载体可以在宿主菌GI724中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A融合蛋白,但不能表达D45A和C50A融合蛋白;pET32a(+)载体可以在宿主菌BL21 (DE3) trxB-中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白,且表达量比在pTrxFus载体/GI724突主菌中表达量高。对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化,并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活,结果表明表达的野生型LTP110分子具有结合脂质的活性。     

新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析

为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。     

裂殖壶菌高产油突变体的高通量筛选

二十二碳六烯酸(DHA)具有促进婴幼儿大脑和视网膜发育等多种生理功能,被广泛应用于食品、医药和养殖等行业。为了获得适合于工业化生产的高产油、高产DHA的裂殖壶菌工程株,文中建立了一套操作简单、快速准确的基于尼罗红染色的高通量筛选方案。首先利用紫外线(UVC)诱变的方式快速构建裂殖壶菌的随机突变体库。然后采用优化后的筛选条件如裂殖壶菌的最佳尼罗红染色条件(二甲基亚砜浓度为20%,尼罗红终浓度为2.0μg/mL,孵育时间为10 min,孵育温度为40℃)和更合理的筛选依据(多功能酶标仪实现高通量测量的单位细胞密度油脂量)等,对3 648株突变体进行筛选,得到了3株高产油突变体(D03432、D05106和D01521)。摇瓶发酵实验表明,这3株突变体在生物量、油脂含量和DHA产量上均高于野生型菌株,其中突变体D03432和D05106的油脂量分别达到了干重的64.74%和63.13%,远高于野生型菌株的43.19%。而且这两株突变体的DHA产量分别是野生型菌株的2.26倍和2.37倍。最后,对突变体D03432和D05106进行了5 L发酵罐发酵培养,相较于野生型菌株,这两株突变体不仅生物量和油脂含量有所增加,而且DHA产量更是分别增加了45.5 1%和66.46%,展现出较好的工业应用潜力。此外,本筛选方案对其他产油微生物高产油突变体的高通量筛选具有借鉴作用。     

Escherichia Coli核糖体蛋白质突变对lac Z表达的影响

测定了Escherichia coli P90CF[rec A ara D (lac pro B) F’ lac I, pro A+ proB+]及其依赖链霉素突变体(StrDA)、抗链霉素突变体(StrRA)、和回复突变体的b-半乳糖苷酶活性。发现StrDA的酶活性大大低于野生型的酶活性，而StrRA的酶活性与野生型的接近。不同的回复突变体，酶活性差别很大，最高的与野生型的接近，大多数阶于野生性与StrDA之间，少数低于StrDA。测定了E. coli A19及其衍生株的b-半乳糖苷酶活性，并与其lcI857成斑率相比较。在VT977(S8+S3+S18+L6+L24+L27)和VT567(S8+L27)中，它们的成斑率分别是野生型的6.02倍和3.56倍，而b-半乳糖苷酶活性只有野生型的19.23%和28.02%。相反，VT711(S8+S4+L6+L24)的成斑率只是野生型的6×10-7，而b-半乳糖苷酶活性仍达野生型的33.20%。     

葡萄球菌B型肠毒素突变体SEB(Y89A,C93S,Y94A)对小鼠的免疫保护作用

目的:评价葡萄球菌B型肠毒素(SEB)突变体SEB(Y89A,C93S,Y94A)作为超抗原疫苗候选分子对小鼠的免疫保护作用。方法:制备具有一定纯度和活性的突变体蛋白SEB(Y89A,C93S,Y94A)样品,灭活后免疫BALB/c小鼠,待小鼠抗体水平上升后,再以野生型SEB(wt-SEB)攻击用D-半乳糖胺致敏的BALB/c小鼠,评价该突变体蛋白的免疫保护作用。结果:突变体蛋白SEB(Y89A,C93S,Y94A)在重组大肠杆菌DH5α中得到表达,主要以包涵体形式存在,经变性、复性、SephacrylS200凝胶过滤,制备成较高纯度(95%)的、具有与wt-SEB相同抗原性的突变体蛋白样品,甲醛灭活后免疫BALB/c小鼠至4周,ELISA法测定小鼠抗体效价水平可达106;进而以wt-SEB攻毒,在达8倍LD50的攻击下,阴性对照小鼠在24h内全部死亡,而SEB(Y89A,C93S,Y94A)组与wt-SEB组小鼠至48h仍有存活。结论:突变体蛋白的保护效果与wt-SEB相类似,有望成为SEB减毒疫苗候选分子。     

增强型金黄色葡萄球菌肠毒素C2突变体及其超抗原活性

金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗.为了增强SEC2的超抗原活性,应用over-lap PCR方法将SEC2中的102～106位GKVTG氨基酸残基分别突变为WWH、WWT和WWP,获得3种突变体ST-1、ST-2和ST-3.三种突变体刺激小鼠淋巴细胞增殖活性和肿瘤细胞生长抑制活性与野生型SEC2相比均有显著提高.ST-1和ST-3的致热活性与野生型SEC2相当,而ST-2的致热活性明显高于野生型SEC2.此外,三种突变体体外刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平也显著提高,这可能是导致突变体具有较高肿瘤细胞生长抑制活性的原因.进一步实验发现,三种突变体刺激下,小鼠脾淋巴细胞mVβ8.2基因的转录水平较野生型SEC2显著增加,暗示突变体对TCR mVβ8.2分子亲和力的提高,可能是其超抗原活性增强的主要原因.     

雌激素受体α磷酸化位点突变体T224A和S559A的构建及其转录激活活性检测

目的:构建雌激素受体α(ERα)T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变。方法:以pc DNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基,插入pc DNA3-Flag载体;将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western印迹检测融合蛋白的表达,采用萤光素酶报告基因方法检测ERα突变体的活性改变。结果:T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达,相对分子质量为66×103。在无雌激素(E2)时,野生型ERα及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、1.49和1.84倍;在雌激素存在时,野生型ERα活性增强了1.57倍,T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍。结论:224位Thr磷酸化修饰对ERα的活性起重要作用,且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱。     

毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。     

人博卡病毒2型VP1U突变对sPLA2活性的影响

对HBoV2 VP1U蛋白进行原核表达并检测其sPLA_2活性,对其关键氨基酸进行突变,检测突变对sPLA_2活性的影响。构建重组质粒pMD18T-VP1U,选取VP1U蛋白4个关键氨基酸为突变点,分别进行原核表达,蛋白纯化后用sPLA_2试剂盒检测sPLA_2活性,对比突变前后VP1U蛋白sPLA_2活性有无变化。野生型HBoV2VP1U蛋白的sPLA_2活性为0.243μmol/min/mL,具有sPLA_2活性;突变体L19P、P21R、D42H及Y45N蛋白的sPLA_2活性分别为野生型蛋白的1.2%、1.2%、0.82%、0.41%。野生型HBoV2VP1U蛋白具有sPLA_2活性,突变体蛋白均几乎完全丧失了sPLA_2活性,提示19、21、42、45位4个氨基酸是维持sPLA_2活性的关键氨基酸。该研究为靶向抗病毒药物的研究提供了理论基础。