体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用．本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪．将sFat—1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植．先后移植了1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠（90％）,7头妊娠足月（70％）分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1．1％（出生仔猪／移植胚胎）．体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响．当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率（100％）,而排卵后移植妊娠足月率为0％．对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87％．RT—PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat—1基因．以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFat-1基因的克隆猪．     

转Fat-1基因猪的制备和整合检测

为了在转基因猪肌肉中高效率表达Fat-1基因,且进一步得到富含ω-3 PUFAs猪品系建立技术基础。将化学合成的人源化Fat-1基因克隆到表达载体上,构建能够在猪细胞中高效表达的质粒构件p MSTN-ω3,使用胚胎原核显微注射方法制备转h Fat-1基因猪。试验对16头供体母猪超数排卵,人工授精配种后手术法冲取320枚1~2细胞期猪胚胎。原核显微注射法向胚胎导入线性化质粒p MSTN-ω3,302枚1~2细胞期胚胎显微注射后移植10头受体母猪,5头母猪妊娠,生产26头仔猪。PCR法检测得到4头转h Fat-1基因阳性猪,Southern印迹杂交分析验证1头猪整合有h Fat-1基因,1头猪近似整合h Fat-1基因。有1头h Fat-1基因整合猪可用于转基因猪育种,表达构件p MSTN-ω3能够用于生产转Fat-1基因猪。试验成功采用显微注射法制备转h Fat-1基因猪,改进、规范了胚胎原核显微注射法制备转基因猪的试验操作程序。     

延迟激活对猪克隆胚胎体外、体内发育效率的影响

为了提高猪克隆效率,获得更多的克隆猪,研究了延迟激活对猪体细胞克隆胚胎体外、体内发育的影响。研究发现,和同步融合激活方法相比,延迟激活虽然会降低克隆重构胚的融合率(P 0. 05),但能够显著提高克隆胚胎的卵裂率(P 0. 01)和囊胚率(P 0. 05);延迟激活方法重构胚使用CB辅助激活4h,其囊胚率均极显著高于不使用CB组(P 0. 01);将克隆胚胎移植到126头受体母猪后,延迟激活组受体母猪分娩率显著高于同步激活组(P 0. 05),虽然在窝均总仔、窝均活仔、克隆效率方面没有显著差异,但延迟激活组显然获得了更多的克隆仔猪。以上结果说明,延迟激活方法能够提高猪克隆胚胎的体外、体内发育效率。     

广西巴马小香猪体细胞克隆

本研究旨在检验新生广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞支持克隆胚胎完全的体内发育潜能,亦即能通过其构建出存活的克隆猪,从而为克隆技术在广西巴马小香猪资源保存和开发上的应用奠定基础。首先制备新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞,用其制备体细胞核移植胚胎,追踪观察体细胞核移植胚胎体外发育潜能,最后通过胚胎移植检验其完全的体内发育潜能。实验结果表明,制备的新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞具有良好的细胞增殖活性,用其制备的体细胞核移植胚胎分裂率和囊胚率分别为77.7%(334/430)和16.5%(71/430),将1 658枚克隆胚胎移植给6头代孕母猪,其中2头妊娠并最终产下8头存活雄性克隆小猪和3头死胎,整体克隆效率为0.66%,存活克隆猪健康状况良好。本研究表明,新生猪肾脏成纤维细胞是一种理想的用于生产体细胞克隆广西巴马小香猪的细胞资源。     

克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度(0～300 nmol/ L)的胚胎培养液中培养不同的时间(0～36 h),观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力.实验结果发现100 nmol/L Scriptaid处理24 h组克隆胚胎的囊胚发育率(30.4%)较对照组(17.5%)显著提高,P<0.05.将100 nmol/L Scriptaid处理24 h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力.处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率(分别为5头,2.4%)均显著高于对照组(分别为1.5头,0.7%),P<0.05.以上结果表明,100 nmol/L Scriptaid处理24 h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率.     

体细胞克隆猪的研究进展

哺乳动物克隆不仅可以保护濒危动物 ,而且与干细胞工程技术相结合能应用于克隆性治疗 ,是目前生物技术领域研究的热点之一 ,具有重大的科学意义和应用价值。由于体细胞克隆猪在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力 ,已成为当今体细胞克隆研究的热点。从 2 0 0 0年开始 ,在不同国家相继诞生了体细胞克隆猪及转基因猪 ,但是其成功效率很低 ( 1 %～ 2 % )。主要综述了影响体细胞克隆猪的几个因素 ,涉及胞质受体、供核细胞、显微操作、激活以及重组胚移植     

体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源, 卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切. 为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量, 进而提高体细胞核移植猪的成功率, 本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T), 分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和 10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养, 以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准, 研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响. T, T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42 h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%, (69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%, 添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率; 3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著, 但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25). 来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管, 其中有3头受体母猪妊娠发育到期, 获得克隆民猪14头, 其中有6头健康成活至今. 实验结果表明, 培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量, 在含有10% pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.     

体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源, 卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切. 为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量, 进而提高体细胞核移植猪的成功率, 本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T), 分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和 10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养, 以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准, 研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响. T, T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42 h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%, (69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%, 添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率; 3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著, 但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25). 来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管, 其中有3头受体母猪妊娠发育到期, 获得克隆民猪14头, 其中有6头健康成活至今. 实验结果表明, 培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量, 在含有10% pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.     

曲古抑菌素A对克隆猪端粒长度的影响

端粒是染色体末端结构, 在细胞分裂时随着DNA复制而缩短, 体细胞核移植能不同程度地延长端粒长度, 但有些克隆动物端粒的长度在体细胞核移植过程中不能有效恢复, 因而这些克隆动物就会表现出早衰现象。文章发现克隆东北民猪以及eGFP、Mx和PGC1α转基因克隆猪的端粒长度与核供体成体成纤维细胞相比显著缩短(P<0.05), 表明体细胞核移植的重编程过程没能延长细胞的“寿命”。曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)是一种去乙酰化酶抑制剂, 有研究表明其能提高某些物种的体细胞核重编程效率。为了使端粒长度有效恢复, 文章利用40 nmol/L TSA处理1细胞期猪克隆胚胎24 h, 结果发现, 与对照组相比, TSA处理能显著地提高克隆胚胎体外发育的囊胚率(16.35% vs. 2 7.09%, 21.60% vs. 34.90%, P<0.05), 而且囊胚期端粒长度也得到显著延长(P<0.05)。克隆胚胎移植受体后得到了TSA处理组与非处理组的克隆猪, 虽然TSA处理并没有提高克隆效率(1.3% vs. 1.7%, TSA vs. control), 但端粒长度与对照组和供体细胞相比均显著延长(P<0.05)。猪体细胞核移植不能有效恢复端粒长度, 但是TSA处理能有效延长克隆猪端粒长度。     

利用CRISPR/Cas9系统建立Xist基因敲除猪模型

体细胞核移植技术在家畜良种繁育、基因修饰动物生产、濒危动物的拯救和人类疾病的治疗等领域具有重要的应用价值,但目前克隆动物生产效率较低,平均不超过5%。低下的克隆效率极大地限制了该技术的快速发展。在影响克隆猪生产效率的诸多因素中,X染色体的异常失活是导致克隆效率低下的重要原因,而与X染色体失活密切相关的一个重要基因是Xist基因,这表明Xist基因可能直接或间接地影响猪的克隆效率。本文以CRISPR/Cas系统为基础,在Xist基因上设计5个CRISPR/Cas系统打靶位点,并筛选出有效的Target 3、Target 4 sgRNA,在细胞水平切割效率为1%和3%,在胚胎水平为75%和85.7%。同时将有效的sgRNA体外转录并显微注射至胚胎体内,发现Target 3和Target 4组合效果最好,敲除效率为100%。通过胞浆注射和胚胎移植方法生产出6头克隆猪,有2头活仔实现完全敲除。本文成功建立Xist基因敲除猪模型,为后续通过敲除猪Xist基因提高克隆效率的研究奠定了基础。     

单、双标记基因筛选的转人乳铁蛋白基因供核细胞生产克隆山羊效率的比较

为比较两种筛选标记基因生产转人乳铁蛋白(hLF)基因克隆山羊的效率,利用单(新霉素抗性基因,Neor)、双(新霉素抗性和绿色荧光蛋白基因,Neor/GFP)标记基因筛选转基因的供核细胞,并制作体细胞核移植转基因山羊。山羊胎儿成纤维细胞电转染单标记基因表达载体(pBLC14)或双标记基因表达载体(pAPLM),分别有58.8%(20/34)和86.7%(26/30)的抗性细胞株检测到外源基因;转染pAPLM的细胞传代培养后,仅有20%(6/30)株细胞在传代中所有细胞均能观察到荧光;分别以pBLC14和pAPLM的细胞株作为供核细胞进行体细胞核移植,共获得806枚重构胚胎,胚胎移植受体后35 d、60 d妊娠率分别为53.8%、26.9%和39.1%、21.7%,最终分别产下5只(1.9%)和7只(1.4%)克隆山羊;经PCR及Southern blotting检测,所有出生山羊均整合有外源基因。结果显示,以单、双标记基因筛选供核细胞,其重构胚融合率、怀孕率和克隆动物出生率差异不显著(P>0.05),Neor/GFP双标记基因能准确、有效地用于转基因供核细胞筛选。同时,结果也表明Neor/GFP双标记基因转染的体细胞作为供核细胞对体细胞克隆效率未出现不利影响。     

广西德保黑猪的体细胞克隆与鉴定

研究旨在于运用体细胞克隆技术生产广西德保黑猪,并运用微卫星技术进行克隆猪胎儿的亲缘鉴定。试验选择广西德保黑猪体细胞作为核移植供体,巴马小型猪作为核移植受体猪;并选择9个微卫星位点以作克隆猪的亲缘鉴定。结果显示受体猪在夏季移植时受孕但流产,而冬季移植时均无受孕;微卫星分析也显示流产胎猪与供核成纤维细胞的亲缘关系一致。结果表明德保黑猪的体细胞克隆是可行的。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛 （英文）

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

整合人lactoferrin基因的山羊体细胞支持核移植克隆胚的体外发育

克隆了人lactoferrin基因和山羊[[beta]]-casein基因5′端调控区, 构建了人lactoferrin的乳腺表达载体, 并将该载体利用脂质体介导转染了奶山羊胎儿成纤维细胞, 获得了稳定整合人lactoferrin基因的转基因体细胞克隆17个, 其中PCR和Southern Blot检测阳性的细胞克隆14个, 阳性率82.4%。以转基因体细胞为供体细胞进行了核移植, 获得了能够体外发育的山羊转基因克隆胚胎, 体内成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为64.8%, 体外成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为51.7%, 证明了山羊转基因体细胞能够支持克隆胚的进一步发育。     

广西巴马小型猪转基因克隆胚胎的体外生产

广西巴马小型猪是一种原产于广西巴马县的小型猪品种,非常适于实验动物化,进行广西巴马小型猪的基因修饰研究,可以显著提升其在生物医学研究中的利用价值。当前最有效的构建转基因猪方法是体细胞核移植,但因用于体细胞核移植生物供体细胞在经受转基因操作后活性显著下降,从而制约了转基因克隆猪的生产效率。Xfect polymer是一种新型转染试剂,具有细胞毒性低和操作简便等优点,已被证明适用于多种真核细胞的转基因操作。本研究旨在利用体细胞核移植技术来检验经Xfect polymer转染制备的广西巴马小型猪转基因体细胞,可否支持猪克隆胚胎完全的体外发育的能力,以期为将来生产模拟人类疾病的转基因克隆广西巴马小型猪奠定基础。     

以经过转染的乳腺上皮细胞生产克隆羊

为研究转基因乳腺上皮细胞发育的全能性,利用电转染方法将人乳铁蛋白(hLF)乳腺特异性表达载体电转染山羊乳腺上皮细胞,经G418和PCR筛选获得阳性克隆细胞株,经催乳素诱导的细胞株上清液用Western blotting方法检测hLF的表达。以转基因与上清液中表达hLF均为阳性的细胞为核供体细胞,进行山羊体细胞核移植。结果为:16株细胞表达重组hLF,分子质量为75 kD;将144枚重构胚移入16只同步发情的山羊输卵管中,在移植后的30 d、60 d和90 d的妊娠率分别为87.5%、81.3%和62.5%;最终3只受体妊娠足月,产下3只克隆羊,克隆效率为2.1%,PCR-RFLP分析表明克隆羊均来自供体羊细胞,但没有整合外源基因。结果表明,hLF转基因乳腺上皮细胞能分泌hLF;乳腺上皮细胞经转染、筛选和长期培养的条件下,能保持发育的全能性。     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列（IRES）连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统，用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法（900 V/cm, 5 ms）转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞，基因转染细胞在添加G418(800 μg/mL) 的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植，重构胚经体外培养至囊胚阶段，选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响，用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5% FBS)，然后恢复培养(10% FBS)10?h使细胞同步化于G1期，以正常培养的细胞作为对照进行核移植。 结果表明，转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2%, P<0.05)；转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响（23.2% VS 18.9%, P>0.05）。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛（每头移植2—4枚胚胎）中有一头妊娠，并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应（PCR）检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

成年耳细胞克隆山羊(Capra hircus)

繁殖季节采集关中奶山羊卵巢,采集获得可用卵母细胞5.5枚/卵巢(1815/330).经约20 h 成熟培养,第一极体排放率66.17%(1201/1815).将有类第二极体排出结构的成熟卵母细胞去核,去核率75.44%(906/1201).培养济宁青山羊耳部皮肤成纤维细胞传2代后液氮冷冻,解冻培养3~6代,用0.5% FBS饥饿2~10 d作为供体细胞.利用卵母细胞胞质内注射法将分离的供体细胞核胞体注入到去核卵母细胞内,注核成功率98.12%(889/906).克隆胚胎用5μmol/L 离子酶素激活4.5 min, 在含2 mmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6 dime-thylaminopurine,6-DMAP)的培养液中培养3 h,然后在mCR1aaBF培养液中培养36 h,卵裂率76.69%(645/841).其中由未经冷藏处理供体细胞克隆得到308枚胚胎,激活后卵裂率、4-细胞发育率、囊胚发育率分别为68.5%(211/308),59.72%(126/211)和17.46% (22/126);另外,由4℃冷藏处理24h供体细胞获得的109枚克隆胚胎,激活率、4-细胞率、囊胚率分别为72.48%(79/109),53.16%(42/79)和19.05%(8/42).统计学分析表明,4℃处理供体细胞对克隆胚胎的早期发育没有显著影响.将102枚发育至4-细胞期的克隆胚胎移植到17只自然发情2~3 d 的受体山羊输卵管,其中非冷藏供体细胞克隆的84枚胚胎移植后没有产仔.18枚冷藏体细胞克隆的胚胎移植获得1只发育足月的克隆山羊.将冷藏或非冷藏处理供体细胞克隆得到的19枚体外发育囊胚移植到自然发情6~8 d 的受体山羊,结果无一产仔.未经冷藏处理供体细胞克隆得到的18枚体外发育桑椹胚移植到自然发情5 d受体山羊后获得1只足月羔羊.微卫星引物PCR扩增结果证实2只克隆山羊来源于同一供体细胞.