小RNA与卵的生长

近日,中国农业大学成功地获得了中国第一头体细胞克隆猪,这是我国独立自主完成的首例体细胞克隆猪,标志着我国已成为第7个(继英国、日本、美国、澳大利亚、韩国及德国之后)拥有自主克隆猪能力的国家,填补了我国在这一领域的空白。猪的体细胞克隆难度     

体细胞克隆猪发育异常研究进展

克隆又称体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT),是一种将已分化的细胞重编程恢复全能性而生产与供体细胞基因型完全相同后代的无性繁殖技术。猪的克隆技术具有重要的应用价值,包括扩繁优良种猪、制备基因修饰猪、保护珍贵和濒危猪种以及研究猪体细胞重编程机制。然而,克隆猪存在出生率和初生重低以及死胎率、新生期死亡率和畸形率高等问题,这些都严重影响了克隆猪的应用前景。供体核的表观重编程错误被认为是克隆效率低和胚胎发育异常的主要原因,但是目前大多数研究通过修正表观重编程错误并没有大幅度提高克隆猪的出生率和健康率。本文综述了克隆猪的异常表型、发育异常的原因以及提高猪克隆效率的有效方法,以期为提高克隆猪的成活率提供参考。     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用.本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪.将sFat-1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植.先后移植了1889枚1~4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠(90%),7头妊娠足月(70%)分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1.1%(出生仔猪/移植胚胎).体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响.当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率(100%),而排卵后移植妊娠足月率为0%.对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87%.RT-PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat-1基因.以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFa...     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用．本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪．将sFat—1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植．先后移植了1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠（90％）,7头妊娠足月（70％）分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1．1％（出生仔猪／移植胚胎）．体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响．当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率（100％）,而排卵后移植妊娠足月率为0％．对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87％．RT—PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat—1基因．以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFat-1基因的克隆猪．     

广西巴马小香猪体细胞克隆

本研究旨在检验新生广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞支持克隆胚胎完全的体内发育潜能,亦即能通过其构建出存活的克隆猪,从而为克隆技术在广西巴马小香猪资源保存和开发上的应用奠定基础。首先制备新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞,用其制备体细胞核移植胚胎,追踪观察体细胞核移植胚胎体外发育潜能,最后通过胚胎移植检验其完全的体内发育潜能。实验结果表明,制备的新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞具有良好的细胞增殖活性,用其制备的体细胞核移植胚胎分裂率和囊胚率分别为77.7%(334/430)和16.5%(71/430),将1 658枚克隆胚胎移植给6头代孕母猪,其中2头妊娠并最终产下8头存活雄性克隆小猪和3头死胎,整体克隆效率为0.66%,存活克隆猪健康状况良好。本研究表明,新生猪肾脏成纤维细胞是一种理想的用于生产体细胞克隆广西巴马小香猪的细胞资源。     

广西德保黑猪的体细胞克隆与鉴定

研究旨在于运用体细胞克隆技术生产广西德保黑猪,并运用微卫星技术进行克隆猪胎儿的亲缘鉴定。试验选择广西德保黑猪体细胞作为核移植供体,巴马小型猪作为核移植受体猪;并选择9个微卫星位点以作克隆猪的亲缘鉴定。结果显示受体猪在夏季移植时受孕但流产,而冬季移植时均无受孕;微卫星分析也显示流产胎猪与供核成纤维细胞的亲缘关系一致。结果表明德保黑猪的体细胞克隆是可行的。     

延迟激活对猪克隆胚胎体外、体内发育效率的影响

为了提高猪克隆效率,获得更多的克隆猪,研究了延迟激活对猪体细胞克隆胚胎体外、体内发育的影响。研究发现,和同步融合激活方法相比,延迟激活虽然会降低克隆重构胚的融合率(P 0. 05),但能够显著提高克隆胚胎的卵裂率(P 0. 01)和囊胚率(P 0. 05);延迟激活方法重构胚使用CB辅助激活4h,其囊胚率均极显著高于不使用CB组(P 0. 01);将克隆胚胎移植到126头受体母猪后,延迟激活组受体母猪分娩率显著高于同步激活组(P 0. 05),虽然在窝均总仔、窝均活仔、克隆效率方面没有显著差异,但延迟激活组显然获得了更多的克隆仔猪。以上结果说明,延迟激活方法能够提高猪克隆胚胎的体外、体内发育效率。     

克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

利用CRISPR/Cas9系统建立Xist基因敲除猪模型

体细胞核移植技术在家畜良种繁育、基因修饰动物生产、濒危动物的拯救和人类疾病的治疗等领域具有重要的应用价值,但目前克隆动物生产效率较低,平均不超过5%。低下的克隆效率极大地限制了该技术的快速发展。在影响克隆猪生产效率的诸多因素中,X染色体的异常失活是导致克隆效率低下的重要原因,而与X染色体失活密切相关的一个重要基因是Xist基因,这表明Xist基因可能直接或间接地影响猪的克隆效率。本文以CRISPR/Cas系统为基础,在Xist基因上设计5个CRISPR/Cas系统打靶位点,并筛选出有效的Target 3、Target 4 sgRNA,在细胞水平切割效率为1%和3%,在胚胎水平为75%和85.7%。同时将有效的sgRNA体外转录并显微注射至胚胎体内,发现Target 3和Target 4组合效果最好,敲除效率为100%。通过胞浆注射和胚胎移植方法生产出6头克隆猪,有2头活仔实现完全敲除。本文成功建立Xist基因敲除猪模型,为后续通过敲除猪Xist基因提高克隆效率的研究奠定了基础。     

我国体细胞克隆牛的研究进展

近年来,由于体细胞克隆技术在畜牧业生产、疾病治疗、生物学基础理论研究及濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值,克隆效率成为科学界研究的热点问题。本文对克隆技术的相关影响因素进行了综述,研究表明,不同细胞系影响到体细胞克隆牛效率,胎儿细胞和颗粒细胞重构胚的囊胚发育率、犊牛成活率比成年成纤维细胞高。关于卵母细胞和克隆胚胎冷冻保存的研究表明,玻璃化冷冻法可以用于克隆胚胎以及卵母细胞的冷冻保存。在此基础上,讨论了国际上哺乳动物体细胞克隆研究新进展和体细胞克隆的效率,指出体细胞克隆中亟待解决的问题。