茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.     

丙型肝炎病毒5

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

丙型肝炎病毒5′-非编码区及其结合蛋白的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定

测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列.该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得.基因组全长为7 059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6 402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴.与已发表的AEV疫苗株1 143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97.6%.结构蛋白(VP1～VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小.与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守.从而进一步确认了AEV的分子特性.     

籽粒苋苹果酸酶基因克隆及分析

NAD/NADP-苹果酸酶(NAD-ME/NADP-ME)是C4植物光合途径的关键酶。采用RT-PCR技术对籽粒苋NAD-ME基因进行克隆,获得了籽粒苋NAD-ME基因的cDNA序列。结果表明,该序列开放可读框长度为1 872 bp,编码623个氨基酸;多序列比对和进化树分析表明,该基因核苷酸序列与其他植物已报道的NAD-ME/NADP-ME基因的核苷酸序列一致性高达75.1%~80.6%,其氨基酸序列与其他植物的NAD-ME/NADP-ME蛋白一致性为73.2%~80.3%。对推断氨基酸序列的蛋白保守区、疏水性/亲水性、潜在跨膜片段、信号肽、蛋白固有无序化和蛋白二级结构分析表明,该蛋白具有苹果酸酶的保守区、兼具亲水性和疏水性,并且含有无序结构域,可能是一种跨膜的非分泌性蛋白。     

小RNA病毒蛋白翻译调控元件研究进展

真核生物的起始复合物并不是在起始AUG处形成 ,而是在mRNA的 5′末端形成 ,其识别信号就是 5′末端的帽子结构。小RNA病毒科成员RNA 5′末端没有帽子结构 ,而有一个病毒编码的小蛋白质与基因组共价相连。小RNA病毒的蛋白翻译起始于 5′非翻译区中的内部顺式调控元件 ,称为内部核糖体进入位点 (IRES)。口蹄疫病毒 (foot and mouthdiseasevirus,FMDV)是该科病毒的典型代表 ,引起偶蹄动物的急性接触性传染病。完整FMDV含有单链正股RNA、衣壳蛋白及少量装配过程中夹带的非结构蛋白和宿主细胞肌动蛋白 ,其基因组RNA全长约 8 5kb ,可直接作为信使RNA。对IRES的一、二级结构进行了比较 ,对IRES与翻译起始因子的相互作用以及对病毒毒力的影响作了综述。     

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因结构比较性研究

用ＰＣＲ方法扩增不同毒力赖型钩体ＯｍｐＬ１基因片段,进行序列测定,用相关软件比较分析核苷酸序列、蛋白质二级结构以及限制性内切酶谱,不同毒力赖型钩体能扩增出９６０ｂｐ的片段,非致病Ｐａｔｏｃ株未能扩出相应片段,中国赖型参考株ＯｍｐＬ１序列（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＦ２５０３１８）与流感伤寒型相应序列比较有９８个核苷酸差异,同源性为８９．８％,二级结构预测和氨基酸疏水图显示变异主要发生在跨膜蛋白的膜     

人溶菌酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:克隆人溶菌酶基因并进行生物信息学分析及构建其原核表达载体方法:采用RT-PCR法扩增人溶菌酶基因,运用相关生物信息学软件对其理化性质、疏/亲水性、功能结构域及蛋白质二级结构等进行分析.将该基因克隆入载体pET32a,PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定.结果:获得约400bp的人溶菌酶基因,其序列与GenBank中公布序列完全一致.生物信息学分析显示人溶菌酶基因编码130个氨基酸,分子量为14.7kDa,理论等电点为9.28,含有一个功能结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重级表达质粒构建成功.结论:该基因的克隆、生物信息学分析及原核表达质粒的构建为进一步研究其功能奠定了基础.     

壳聚糖酶的克隆表达与壳寡糖的制备分析

目的:克隆壳聚糖酶基因于大肠杆菌中实现高表达,制备壳寡糖。方法:以枯草芽孢杆菌总DNA为模板扩增壳聚糖酶基因(CSN),克隆至载体pET23a(+)上,转化菌株BL21(DE3)。重组子经0.5 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和质谱检测与鉴定重组酶。酶纯化后水解壳聚糖,薄层色谱分析其水解产物。结果:质谱证明壳聚糖酶(31.5kDa)成功表达,表达量占菌体总蛋白的45%左右。纯化后重组酶浓度为900 mg/L,纯度95%、回收率85%,酶活力为10 000 U/mg。壳聚糖降解产物为壳二糖至壳四糖。结论:原核表达载体pET23a(+)-CSN构建正确,壳聚糖酶表达量与活性高,适用于水解壳聚糖制备壳寡糖。     

国内外蝗害治理技术现状与展望

本文首先概述了国内外蝗虫发生与为害的态势,总结了现阶段我国蝗虫发生与为害的主要特点:即农田飞蝗暴发频繁而且严重,草原土蝗的发生时常造成严重的经济损失,而且侵入城市干扰市民生活,我国与周边国家之间蝗虫过境迁移频繁,使用化学农药污染环境和农产品;分析了国内外蝗虫防治对策与技术的发展现状,重点介绍了应急防治和可持续治理对策、...     

Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin

The nanomechanical properties of the coiled-coils of myosin are fundamentally important in understanding muscle assembly and contraction. Force spectra of single molecules of double-headed myosin, single-headed myosin, and coiled-coil tail fragments were acquired with an atomic force microscope and displayed characteristic triphasic force-distance responses to stretch: a rise phase (R) and a plateau phase (P) and an exponential phase (E). The R and P phases arise mainly from the stretching of the coiled-coils, with the hinge region being the main contributor to the rise phase at low force. Only the E phase was analyzable by the worm-like chain model of polymer elasticity. Restrained molecular mechanics simulations on an existing x-ray structure of scallop S2 yielded force spectra with either two or three phases, depending on the mode of stretch. It revealed that coiled-coil chains separate completely near the end of the P phase and the stretching of the unfolded chains gives rise to the E phase. Extensive conformational searching yielded a P phase force near 40 pN that agreed well with the experimental value. We suggest that the flexible and elastic S2 region, particularly the hinge region, may undergo force-induced unfolding and extend reversibly during actomyosin powerstroke.     

Kinetics and thermodynamics of peroxidase- and laccase-catalyzed oxidation of N-substituted phenothiazines and phenoxazines

N -substituted phenothiazines (PTs) and phenoxazines (POs) catalyzed by fungal Coprinus cinereus peroxidase and Polyporus pinsitus laccase were investigated at pH 4–10. In the case of peroxidase, an apparent bimolecular rate constant (expressed as k _cat/K _m) varied from 1 ×10⁷M⁻¹s⁻¹to 2.6×10⁸M⁻¹s⁻¹ at pH 7.0. The constants for PO oxidation were higher in comparison to PT. pH dependence revealed two or three ionizable groups with pK _a values of 4.9–5.7 and 7.7–9.7 that significantly affected the activity of peroxidase. Single-turnover experiments showed that the limiting step of PT oxidation was reduction of compound II and second-order rate constants were obtained which were consistent with the constants at steady-state conditions. Laccase-catalyzed PT and PO oxidation rates were lower; apparent bimolecular rate constants varied from 1.8×10⁵M⁻¹s⁻¹ to 2.0×10⁷M⁻¹s⁻¹ at pH 5.3. PO constants were higher in comparison to PT, as was the case with peroxidase. The dependence of the apparent bimolecular constants of compound II or copper type 1 reduction, in the case of peroxidase or laccase, respectively, was analyzed in the framework of the Marcus outer-sphere electron-transfer theory. Peroxidase-catalyzed reactions with PT, as well as PO, fitted the same hyperbolic dependence with a maximal oxidation rate of 1.6×10⁸M⁻¹s⁻¹ and a reorganization energy of 0.30 eV. The respective parameters for laccase were 5.0×10⁷M⁻¹s⁻¹ and 0.29 eV. Received: 20 September 1999 / Accepted: 24 February 2000     

白术同源四倍体的诱导和鉴定及其与二倍体过氧化物酶的比较

以白术（Atractylodes macrooephala Koidz.）二倍体组培苗为材料,对其四倍体诱导方法进行研究,共获得45个白术同源四倍体株系,为优良株系的选育提供了材料。此外,还分析比较了其中8个白术四倍体株系与二倍体的过氧化物酶同工酶（POD）的酶谱差异,发现四倍体各株系过氧化物酶同工酶谱比二倍体的均多了Rf0.310的谱带,且总过氧化物酶比活力也发生了很大改变,对探讨白术四倍体优良株系的生理生化机理具有一定的参考价值。     

放牧对牧草光合作用、呼吸作用和氮、碳吸收与转运的影响

研究放牧对草地植物生理活动的影响,对于揭示草地放牧演替的生理机制有重要意义.大量研究表明,家畜放牧对牧草光合作用、呼吸作用以及C和N吸收与转运的影响,可以分为生理伤害和生理恢复2个阶段.放牧通过改变草地冠层结构影响牧草光合作用,净光合作用速率短期内迅速下降,随着叶面积指数增加又逐渐上升,呼吸作用有相似的变化趋势.牧草放牧后再生长所需的C和N最初主要来自根系和留茬中的贮藏物质,此后随着牧草生长恢复逐渐由同化作用供给,C代谢与土壤N水平负相关.放牧后牧草生理活动变化与牧草遗传特性、种间竞争、家畜放牧特征、非生物环境等因素密切相关.     

Synthesis of hapten and conjugates of coumestrol and development of immunoassay

3-O-Carboxymethylcoumestrol was prepared as the hapten for immunoassay by a partial alkylation of coumestrol with ethyl chloroacetate in acetone alkalized with potassium carbonate. 3-O-Ethoxycarbonylmethylcoumestrol was separated by column chromatography and finally was hydrolyzed with formic acid. 1H and 13C NMR data (APT, COSY, HMQC, and HMBC) revealed that the reaction was regioselective, as 3-O-ethoxycarboxymethylcoumestrol was the only monosubstituted derivative. The hapten was then conjugated to bovine serum albumin and used for immunization of rabbits. A radioimmunoassay (RIA) system was established based on the polyclonal antiserum and a 125I-labeled hapten-tyrosine methyl ester conjugate as the radioligand. Parameters of the RIA: sensitivity: 12 pg per tube, 50% intercept: 140 pg per tube, working range: 20-4000 pg per tube. The cross-reactivity of a panel isoflavonoid and lignan phytoestrogens was either negligible (e.g. formononetin 0.07%; biochanin A 0.06%) or not detectable at all. The major immunoreactive peak in HPLC fractions from an alfalfa extract had the same retention time as coumestrol standard and represented 94.8% of the signal. The remaining 5.2% of immunoreactivity was distributed between five minor peaks. We conclude that after the validation for particular matrices, the method will be a useful tool for analysis of coumestrol, especially in low volume and low concentration samples.