茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

小RNA病毒蛋白翻译调控元件研究进展

真核生物的起始复合物并不是在起始AUG处形成 ,而是在mRNA的 5′末端形成 ,其识别信号就是 5′末端的帽子结构。小RNA病毒科成员RNA 5′末端没有帽子结构 ,而有一个病毒编码的小蛋白质与基因组共价相连。小RNA病毒的蛋白翻译起始于 5′非翻译区中的内部顺式调控元件 ,称为内部核糖体进入位点 (IRES)。口蹄疫病毒 (foot and mouthdiseasevirus,FMDV)是该科病毒的典型代表 ,引起偶蹄动物的急性接触性传染病。完整FMDV含有单链正股RNA、衣壳蛋白及少量装配过程中夹带的非结构蛋白和宿主细胞肌动蛋白 ,其基因组RNA全长约 8 5kb ,可直接作为信使RNA。对IRES的一、二级结构进行了比较 ,对IRES与翻译起始因子的相互作用以及对病毒毒力的影响作了综述。     

RNA病毒翻译调控元件—内部核糖体进入位点(IRES)

真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5′端非翻译区（untranslated region,UTR）翻译调控的顺式作用元件——内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）.它 们能够在一些反式作用因子的辅助下,招募核糖体小亚基到病毒mRNA的翻译起始位点.前,依赖IRES元件翻译起始的RNA病毒在哺乳动物,无脊椎动物及植物中均有发现.因此,对RNA病毒IRES元件的深入研究,不仅有助于阐明相关疾病的发生机理,而且为工业应用和疾病治疗提供借鉴意义.本文对RNA病毒IRES元件发现、分类、结构与功能等作了综述.     

从茶尺蠖中分离到一株微小RNA病毒

从核型多角体病毒(NPV)感染致死的茶尺蠖幼虫尸体中分离到一株微小RNA病毒(EoPV)透射电镜观察纯化的病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒。16％的SDS-PAGE显示它有两个分子量为31．5kDa和28．8kDa的衣壳蛋白，后者的含量是前者的2、5倍。3′端克隆序列分析表明EoPV基因组3′有poly(A)尾，编码RNA聚合酶(RdRp)，含有微小RNA病毒RNA聚合酶的八个保守基序，同源性分析表明它与榕透翅毒蛾微小RNA病毒(PnPV)亲缘关系最近。这些特点表明该病毒为一株新的微小RNA病毒。     

小RNA病毒3'非编码区结构与功能的研究进展

小RNA病毒基因组的两侧分别为5′非编码区(UTR)和3′UTR。研究表明:5′/3′UTR能形成复杂的RNA结构,如颈-环结构、三叶草结构和假结体结构等,在病毒的复制或翻译过程中发挥重要调节作用。本文即对近10年来有关小RNA病毒3′UTR的结构与功能研究方面的进展情况进行综述。     

从茶尺蠖中分离到一株微小RNA病毒

从核型多角体病毒(PV)感染致死的茶尺蠖幼虫尸体中分离到一株微小RNA病毒(oPV)透射电镜观察纯化的病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒.16%的SDS-PAGE显示它有两个分子量为31.5 kDa和28.8 kDa的衣壳蛋白,后者的含量是前者的2.5倍.3′端克隆序列分析表明EoPV基因组3′有poly(A)尾,编码RNA聚合酶(dRp)含有微小RNA病毒RNA聚合酶的八个保守基序,同源性分析表明它与榕透翅毒蛾微小RNA病毒(nPV)亲缘关系最近.这些特点表明该病毒为一株新的微小RNA病毒.     

3′-poly(A)~-病毒RNA的大分子cDNA的合成和克隆

为了合成3′端无poly(A)的病毒RNA(登革热病毒Ⅱ)的3′区的长的cDNA,我们用RNA连接酶,把3′端被pCp封闭了的poly(A)<50bp连在病毒RNA的3′端,构成一个病毒RNA-poly(A)-pCp型模板,可用oligo(dT_(10-12))作引物,再用Watson和Jackson(1985)的RNase H代替硷降解法来合成cDNA。结果获得了≥5kb的cDNA。重组克隆的鉴定证明这个大分子cDNA确是病毒RNA 3′区的拷贝。这将有利于对这类RNA病毒基因组的结构-功能分析和对病毒cDNA拷贝的感染性的研究。     

茶尺蠖小RNA病毒全长cDNA克隆的构建

为了初步研究茶尺蠖小RNA病毒(Ectropis oblique picorna-like virus, EoPV)的复制机制,从被EoPV感染致死的茶尺蠖幼虫中分离并纯化病毒粒子,提取病毒RNA,根据已公布的EoPV核苷酸序列,利用基因组上单一的酶切位点,设计特异性引物,应用RT-PCR扩增出5个覆盖全长的片段。 随后采用融合PCR将5个片段拼接,最终将全长定向克隆到低拷贝质粒载体上,成功构建cDNA全长克隆p-EoPV。 双酶切及测序鉴定证明全长克隆构建成功。 与原序列比较发现,该克隆在氨基酸水平上有8个突变和1个缺失。 本研究为深入探讨EoPV病毒生物学特性、病毒复制机理等奠定了基础     

棉铃虫5型质型多角体病毒RNA聚合酶的确定与功能机制研究

棉铃虫5型质型多角体病毒属于呼肠孤病毒科质型多角体病毒属,以重要农业害虫棉铃虫为其天然宿主,对棉铃虫的生物控制具有重要意义.本文对棉铃虫5型质型多角体病毒第3片段编码的蛋白的功能进行了初步研究.首先通过同源性对比,推测其所编码的蛋白可能行使RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的功能.通过体外活性研究确定了该蛋白的RdRP活性,并确定了其保守活性位点GDD.随后以病毒基因组RNA和3′-OH封闭的病毒基因组RNA为模板,利用Northern blot方法研究该蛋白起始病毒基因组RNA合成的分子机制.结果表明,该病毒的RdRP主要通过引物非依赖的方式起始病毒基因组RNA的合成,并且该RdRP蛋白并不具有末端转移酶活性.最后,对RdRP行使功能的生化条件进行探索,发现RdRP功能的发挥需要二价金属离子Mg2+的存在.     

丙型肝炎病毒5

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

水稻基因组中的小RNA

水稻是一种很重要的模式植物, 其基因组框架图的完成将对植物生物学和遗传进化学等学科的研究做出巨大贡献. 目前, 水稻科研工作者们在绘制水稻完成图谱的同时, 也正在对水稻中基因和非编码区序列进行着深入的研究. 非编码RNA在生物系统中有着很重要的作用. 小RNA是非编码RNA的一种, 我们在水稻基因组中寻找已知小RNA序列, 并且在拟南芥、玉米、酵母、线虫、老鼠和猪这6个物种中一一进行比对, 结果在552个小RNA的数据库中找到160个小RNA, 它们存在于水稻的108个Scaffold中, 其中绝大部分(99.41%)都位于基因预测的内含子区. 19个小RNA只存在于水稻基因组中. 发现了两段U14小RNA保守片段, 一段是位于同系列的5个小RNA ZMU14SNR9(s)中, 它们只出现在3个植物物种上, 其中86%序列都是和水稻、拟南芥、玉米重复的序列; 另一段保守的小RNA是XLHS7CU14, 它出现在除猪以外的其他6个物种中. 所有这些结果显示小RNA在植物和动物之间并没有明显的界限.     

昆虫小RNA病毒研究进展

昆虫小RNA病毒依据基因组结构特点分为家蚕软化病毒组、蟋蟀痹病毒组和豌豆蚜病毒组。昆虫小RNA病毒蛋白质翻译具有独特性：不依赖于帽子结构,不需要启始因子eIF1、eIF1A和帽子结合蛋白eIF4E;而且蟋蟀痹病毒组和豌豆蚜病毒组结构蛋白翻译从内部核糖体进入位点独立启始,启始密码子是CUU。该文还简介了昆虫小RNA病毒复制机理及与其它动、植物小RNA病毒或类小RNA病毒的亲缘关系等的研究进展。     

丙型肝炎病毒5′-非编码区及其结合蛋白的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

一种简单高效扩增人杯状病毒ORF2区RT-PCR方法的建立及其意义

人杯状病毒(human calicivirus,HuCV)属于杯状病毒科(Caliciviridae),是单股正链RNA病毒,长约7·5 kb,其3′末端有poly(A)结构。它可分为两个属:诺如病毒(Norovirus)和札如病毒(Sapovirus)[1],根据病毒抗原性和核苷酸序列的多样性,目前将诺如病毒和札如病毒分别划分为三个遗传组(group),每一遗传组依据RNA多聚酶及衣壳蛋白区域序列的差异,可进一步划分为不同群或基因型(cluster or genotype)。病毒基因组包括3个开放读码框(open reading frame,ORF),5′端和3′端各有一个小的非编码区。ORF1编码非结构蛋白的前体聚蛋白,其中包括RNA…     

戊型肝炎病毒亚基因组RNA的研究

本文利用同位素代谢标记在HEV感染85～10.5,6.5～7.5h分别检测到1及2个亚基因组RNA,而感染21h后及在成熟的病毒颗粒内未能检测到亚基因组RNA。通过杂交实验,发现HEV的亚基因组RNA具有典型的共3′端的半套式结构,且基因组RNA与亚基因组RNA的5′端不存在共同的引导序列。通过紫外转录图谱发现HEV的亚基因组RNA是通过独立转录的方式产生的。利用引物延伸反应发现两种亚基因组RNA的转录起始位点分别位于RNA聚合酶区及非结构区、结构区的基因间序列。     

RNA病毒基因组和转录复制多样性的分子基础

自然界中RNA病毒的种类和数量比DNA病毒多得多,根据基因组类型,RNA病毒可分为多种类型,许多研究者认为,存在于古细菌Myxobacteria中,仅仅有一个逆转录酶基因的反转子（Retron)可能是所有病毒的祖先,进化的模式如下,反转子→反座子→反转录转座子→反转录病毒→副反转录病毒→DNA病毒,RNA病毒转录。／复制在很多特征上与DNA病毒迥然不同,依赖于RNA的RNA聚合酶是RNA病转录／复制的主要催化剂,RNA病毒基因组转录和复制都从3'端poly(A)或类tRNA结构或其他结构起始,内部终止是转录,通读到5'末端终止是复制,RNA病毒的模板有正链病毒（RNA模板,负链病毒RNA模板和全长正负链反基因组RNA模板,RNA模板的选择调控机制非常复杂,目前知之甚少,选择模板,RNA聚合酶与转录因子结合形成复制体是两种主要的调控方法,另外,5'UTR和3'UTR也可以调控RNA病毒的转录。     

小RNA病毒3C蛋白酶研究进展

小RNA病毒科病毒包括数目众多的小RNA病毒,其中很多小RNA病毒是人畜重要的病原体。不同种属的小RNA病毒的3C蛋白酶具有典型的G-X-C-G基序和Cys-His-Asp/Glu催化中心;小RNA病毒3Cpro完成P1区VP2~VP3、VP3~VP1;P2区的2A~2B、2B~2C以及整个P3区成熟剪切;小RNA病毒多聚前体蛋白3Cpro成熟剪切分析显示,3Cpro作用底物具有明显的Q-G/S/A/V/H/R和E-S/G/R/M喜好性及种属特异性;固有免疫应答重要配体分子TRIF、MAVS、IRF3、IRF7和NEMO的3Cpro酶切位点预测显示,不同配体分子具有数目各异的可能酶切位点,其中TRIF和NEMO的3Cpro可能作用位点具有多样性。上述问题的探究,为基于小RNA病毒3Cpro的广谱抗病毒药物研制和小RNA病毒免疫逃逸机制提供资料。     

微小RNA与免疫调节

微小RNA(miRNA)是一类22核苷酸的高度保守的小分子非编码RNA,主要通过与靶mRNA的3′非编码区碱基互补配对结合而引起靶RNA降解或翻译抑制.越来越多的研究显示,miRNA在免疫反应中具有新型调节作用,包括调节免疫细胞的发育和分化、B细胞抗体的产生、炎性介质的释放、细胞信号转导等.miRNA在维持机体免疫系统...     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属.序列分析表明,GCRV S2 片段长为3 877核苷酸,编码一个分子量为138kDa 的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质.为进一步了解该病毒 RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)保守区(约1.5kb)重组质粒pR/RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的 pR/RRpN及pR/RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达.筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白.Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV-VP2血清呈阳性反应.通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90%纯的目的蛋白.上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据.     

小RNA病毒非结构蛋白2B的viroporin特性研究进展

小RNA病毒2B蛋白是一种非结构蛋白,其中部分已被证实隶属于viroporin家族,而viroporin是由病毒编码的一类小分子量疏水跨膜蛋白,可通过增大宿主细胞膜结构通透性扰乱其生理学功能而保证病毒完成生命周期。本文主要对小RNA病毒2B蛋白的viroporin特性及生物学功能进行阐释,以便加深对小RNA病毒复制及增殖的理解,并为抗病毒药物的研发提供参考。