双链RNA和植物对病毒的抗性

双链RNA能诱导转录后的基因沉默,是生物抵御病毒入侵、维持自身基因稳定的一种自我保护机制.把源自病毒的基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的高抗性.RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在风险,具有较高的生物安全性.双链RNA抗病毒转基因正在成为一种高效、安全的植物抗病毒策略.     

一种马铃薯高效无标记转基因技术的建立

用农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种紫花白的叶盘,通过1/4 MS培养基预培养、热激处理、低pH、高糖培养基共培养,之后利用PCR直接检测转化体,结果表明遗传转化效率可达5.1%,建立了马铃薯无标记转基因技术.该技术受基因型的限制小,用于其它3个不同的栽培品种东北白、晋薯7号和早大白,遗传转化效率亦达到了4.1%~8.3%.利用这项无标记转基因技术,在载体构建时就剔除了标记基因,遗传转化后直接分化培养,不必对转化细胞进行抗性筛选,缩短了遗传转化周期,省去了费时费力的标记基因剔除步骤,亦为重复转化聚合多个优良基因提供了便利.     

籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及其特征分析

丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)是C4植物在光合过程中的关键限速酶之一。本研究采用RT-PCR技术,从籽粒苋叶片中克隆到籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶基因cDNA全长。核苷酸序列分析表明,该基因cDNA序列开放阅读框全长为2 871 bp (GenBank登录号:JF907701.1),可编码956个氨基酸,分子量为104 kD。籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶PPDK与长寿花(Kalanchoe fedtschenko)、冰叶日中花(M.crystallinum)和板栗(Castanea mollissima)等双子叶植物PPDK的同源性较高,分别为82.5%、82.0%和81.4%;与稗草(Echinochloa crusgalli)、高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)等单子叶植物PPDK的序列一致性分别为74.5%、74.5%和73.9%。进化树分析表明,其与禾本科植物长寿花最为接近。半定量RT-PCR研究表明,该基因受光诱导而上调表达,且在绿色叶片中的表达水平最高。克隆籽粒苋PPDK基因将为今后作物高光效分子育种提供备选基因。     

籽粒苋丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密码子偏好性

运用CHIPS、CUSP和CodonW等程序分析了双子叶C₄植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密码子偏好性, 并与马铃薯(Solanum tuberosum)和苜蓿(Medicago truncatula)等双子叶植物及水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)等单子叶植物进行了比较, 建立了聚类树状图, 以期在作物高光效基因工程中为籽粒苋PPDK基因选择合适的受体植物提供依据。研究结果表明, 籽粒苋PPDK基因偏好于以A或T结尾的密码子, 与其它几种被比较的双子叶作物的PPDK基因密码子偏好性趋势一致, 而玉米和水稻等单子叶植物更偏好使用以G或C结尾的密码子。PPDK基因密码子使用偏好性的系统聚类分析表明, 籽粒苋与马铃薯和苜蓿等双子叶植物聚为一类, 而稗草(Echinochloa crusgalli)、玉米和高粱(Sorghum bicolor)等单子叶植物聚为一类, 与系统进化地位一致。但单子叶植物水稻的密码子偏好性与籽粒苋较为接近, 与玉米和高粱相差较远。为了选择合适的蛋白质表达系统, 比较并分析了籽粒苋PPDK基因的密码子偏好性与大肠杆菌(Escherichia coli)及酵母菌的异同, 发现其与酵母菌的差异小于大肠杆菌, 表明选择酵母菌表达系统更为合适。     

谷子品种抗旱性的苗期快速鉴定

报道了在苗期快速鉴定谷子品种抗旱性的实验结果.通过比较种子在甘露醇渗透胁迫条件下的相对萌发率和芽生长抑制率、幼苗在适度控水条件下的相对含水量和水势、幼苗严重失水恢复供水后的存活率等几个指标,对5个谷子品种(鲁7060、羊角黄、豫谷5号、Jun 24和Mar 51)的苗期抗旱性进行鉴定.结果表明,Mar 51在所鉴定的品种中具有相对的抗旱优势,可以作为谷子苗期抗旱性研究的代表性材料.谷子种子在甘露醇渗透胁迫条件下的相对萌发率与幼苗在适度控水条件下相对含水量的变化趋势一致,初步认为这两个指标可以作为苗期快速鉴定谷子抗旱性的筛选指标.     

靶向番茄SlACS2基因CRISPR-Cas9 sgRNA的设计和分析

番茄为呼吸跃变型果实,伴随呼吸跃变产生大量乙烯,即系统II乙烯,易使番茄果实过熟,导致腐烂变质。SlACS2是番茄系统II乙烯合成的限速酶,通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统修饰该基因,调控系统II乙烯过量表达,将迟滞番茄过熟。本研究基于RNA-seq建立了SlACS2基因的数字表达谱,表明该基因呈果实特异性表达,在植株的根、茎、叶等部位不表达。SlACS2位于番茄1号染色体,含4个外显子和3个内含子。利用在线工具CRISPRdirect 和CRISPR-P发现第1、2、3外显子分别具有18、9和11条sgRNA。其中,sgRNA1-14和sgRNA3-8及二者的近PAM的12 nt 种子序列在番茄基因组是唯一序列,GC含量高于40%,不存在TTTT终止序列。BLAST结果表明,sgRNA1-14和sgRNA3-8与GenBank公布的8条SlACS2同源序列高度一致,位于该基因的保守区,而与SlACS4和SlACS6的同源序列存在多个SNP,预示这2条sgRNA可用于番茄不同品种SlACS2基因的靶向编辑,并可规避对SlACS家族其他同源基因的脱靶效应。     

籽粒苋苹果酸酶基因克隆及分析

NAD/NADP-苹果酸酶(NAD-ME/NADP-ME)是C4植物光合途径的关键酶。采用RT-PCR技术对籽粒苋NAD-ME基因进行克隆,获得了籽粒苋NAD-ME基因的cDNA序列。结果表明,该序列开放可读框长度为1 872 bp,编码623个氨基酸;多序列比对和进化树分析表明,该基因核苷酸序列与其他植物已报道的NAD-ME/NADP-ME基因的核苷酸序列一致性高达75.1%~80.6%,其氨基酸序列与其他植物的NAD-ME/NADP-ME蛋白一致性为73.2%~80.3%。对推断氨基酸序列的蛋白保守区、疏水性/亲水性、潜在跨膜片段、信号肽、蛋白固有无序化和蛋白二级结构分析表明,该蛋白具有苹果酸酶的保守区、兼具亲水性和疏水性,并且含有无序结构域,可能是一种跨膜的非分泌性蛋白。