低温胁迫后抗寒茶树品种‘紫阳圆叶’的基因差异表达分析

采用DDRT—PCR技术,对低温（4℃）胁迫处理不同时间（0、8、12、24和48h）后茶树[Camellia sinensis（Linn．）O．Ktze．]抗寒品种‘紫阳圆叶’（‘Ziyangyuanye’）叶片中差异表达的基因进行分离和测序,并采用半定量RT-PCR对差异表达基因的表达特性进行了比较。结果表明：有12个引物对扩增出有明显差异的cDNA片段,其中3个片段是与抗寒性相关的差异片段,分别被命名为Csgsf．Cscafl和Cscaf2,碱基数分别为217、316和232bp。比对结果显示：Cscaf与茶树品种‘安吉白茶’（‘Anjibaicha’）和‘龙井43’（‘Longjing43’）的谷氨酰胺合成酶基因的同源性分别为96％和91％,与菜豆（Phaseolus vulgaris Linn．）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn．）、油棕（ElaeisguineensisJacq．）、西洋参（Panax quinquefolius Linn．）和水稻（Oryza sativa Linn．）等植物的谷氨酰胺合成酶的基因序列同源性均达到90％以上,因此,Cscafl应为茶树谷氨酰胺合成酶基因片段;Cscaf2与干旱胁迫条件下茶树表达的cDNA的同源性为100％,为茶树应答干旱和低温胁迫的基因片段;Cscafl未检索出同源序列,推测其为与冷胁迫相关的未知基因片段。半定量RT—PCR分析结果表明：Cscafl和Cscafl在低温胁迫的初始期即开始表达且表达量随低温胁迫时间延长逐渐下调;而Cscaf2的表达量随低温胁迫时间延长逐渐上调并在胁迫48h后达到最大,3个片段的表达特性均与差异扩增结果相符。     

仔猪腹泻抗性相关特异表达ESTs的筛选

以久仰香猪、剑白香猪和长白猪3个品种的脾脏为材料,以品种间同一组织不同的发病状态为对照,将DDRT—PCR技术与银染法相结合进行差异显示研究,筛选与仔猪腹泻抗性相关的特异表达ESTs。在脾脏未发病RNA池中检测到5条特异表达ESTs,其中一条与Nck转导蛋白同源,一条与长散布元件反转录酶同源,一条为相似性较高的未知功能序列,两条为新序列。     

Plasmodium yoelii: the effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi

The sporogonic development of the malaria parasite takes place in the mosquito and a wide range of factors modulates it. Among those, the contents of the blood meal can influence the parasite development directly or indirectly through the mosquito response to the infection. We have studied the effect of a second blood meal in previously infected mosquitoes and the effect of anti-sporozoite immune serum on parasite development and mosquito response to the infection. The prevalence and intensity of infection and gene expression of both Plasmodium yoelii and Anopheles stephensi was analyzed. We verified that a second blood meal and its immune status interfere with parasite development and with Plasmodium and mosquito gene expression.     

花椰菜细胞质雄性不育系及保持系中特异序列的克隆、分析

以细胞质雄性不育花椰菜ogura-A和相应的保持系ogura-B为材料进行ISSR及DDRTPCR分析.选用30条ISSR引物,经扩增共产生306条清晰可辨的条带.每条引物可产生6-12条带,其中引物ISSR3在两系中呈现多态性扩增,在保持系中特异扩增出一条1100 bp的片段,序列分析表明该片段与油菜、拟南芥线粒体基因组的部分序列高度相似.推测其可能来源于花椰菜线粒体基因组.在DDRT-PCR分析中,选用3条锚定引物、15条随机引物进行组合,最终共获得1 122条大小在1 000-50 bp的带.经反向Northern杂交验证只有4条带特异的存在于两系中,分别命名为ogura-A205、ogura-A383、ogura-B307、ogura-B352.其中ogura-A205、ogura-A 383只在细胞质雄性不育系中表达,而ogura-B307、ogura-B352在保持系中呈现特异性表达,分析表明四个差异序列均为首次报道.其中ogura-A205、ogura-B307至今尚未发现与之相似的序列,有待于进一步研究;ogura-A383、ogura-352与报道的拟南芥、大白菜等的叶绿体基因的一些片段具较高相似性,推测ogura-A33、ogura-B352搅可能来源于花椰菜叶绿体基因组.以上结果为进一步阐明花椰菜细胞质雄性不育及育性保持的分子机制提供了新线索.     

小麦抗黄矮病基因相关cDNA片段的克隆

以从小麦品种间杂交组合川35050/山农483 F7株系中分离出的感、抗小麦黄矮病的2个近等基因系为材料,利用DDRT-PCR技术和抗病基因保守结构域序列设计的7条简并或特异引物进行差异显示,PCR分析获得4条差异序列,并分别命名为:Rbdv1~Rbdv4(GenBank注册号:EU267934~EU267937).以Rbdv1为靶序列,利用RACE对其3′末端进行PCR扩增,得到长778 bp、末端有poly(A)尾巴的序列.用DNAMAN软件将3′RACE得到的序列与靶序列拼接得到1 196 bp长的片段,命名为A1(GenBank注册号:EU267938).BlastN分析表明,A1与拟南芥、水稻中CDC48蛋白的同源性分别为81%和90%,其氨基酸序列中包含1个P-Loop,具有R基因的特征结构域,推测该片段很可能与抗小麦黄矮病基因相关.     

小麦光温敏雄性不育相关基因的DDRT－PCR分析及功能预测

 以小麦光温敏雄性不育系BS210为试材,分别在北京顺义（可育环境）和安徽阜阳（不育环境）两种诱导育性表现的生态环境下种植,并于雌雄蕊分化期、药隔形成期、花粉母细胞形成期、四分体期和单核期5个时期提取小穗组织的RNA,利用DDRT-PCR方法分离不育系在光、温因子诱导下的差异表达mRNA,并通过反向Northern 进行验证.对获得的20条差异表达的EST进行了测序和BLAST分析,得到了4个候选基因的片段,对其进行5′Race 扩增、序列分析及功能预测.结果表明：它们分别与水稻的DNA修复重组蛋白基因rad50、小麦穗部表达的LRR重复序列型类受体激酶基因、玉米叶片坏死斑点L1s1基因的序列相似性分别为89%、89%和88%,另外还筛选到1个未知功能的新基因片段,它和rad50分别在可育和不育环境下表达的mRNA具有相同的5′端编码区,但3′端非编码区     

正交设计优化东亚砂藓DDRT-PCR反应体系

利用正交实验设计L25（5^6）对东亚砂藓（Racomitrium japonicum）DDRT—PCR反应体系的6因素（Mg^2＋、dNTP、锚定引物、随机引物、模板DNA、Taq酶）在5个水平上进行优化实验。结果筛选出各反应因素的最佳体系（20μL）为：Mg^2＋2．25mmol／L、dNTP0．4mmol／L、锚定引物1．0μmol／L、随机引物0．7μmol／L、模板DNA1．6μL、Taq酶2．5U。对东亚砂藓DDRT—PCR最佳反应体系进行梯度PCR引物退火温度筛选,得到的最佳退火温度为45．4℃。该优化体系的建立,为进一步进行东亚砂藓抗旱基因的筛选与克隆等一系列分子研究提供了重要参考依据。     

细菌侵染的两种鲤鱼病生理反应及抗病性分析

通过人工接种嗜水气单胞菌(A.hydrophila)对受到细菌侵染的鲤鱼两个品种松浦鲤和德国镜鲤的病生理进行检测和分析,并采用DDRT-PCR方法对两种鲤的明显的抗感病个体基因差异进行初步分析。对血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)记数,尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、血糖(GLU)等生理生化指标进行了检测。人工接种试验表明,松浦鲤具有较强的抗病性,而德国镜鲤抗病性很差而感病性很强。DDRT-PCR结果表明,抗性基因在不同的鲤鱼群体之间及同种鲤鱼群体的不同抗感病个体之间表达水平不同。生理生化指标的变化反映出这两种鲤的抗性差异,在外来致病菌的刺激下,实验鲤体内的生理生化水平发生了变化,其中一些生化指标如谷丙转氨酶和总蛋白大幅度下降,其它生理指标表现出上升的趋势。总之松浦鲤在面对致病菌的侵染时从表型到生理生化水平上均表现出较强的抗病性。