细胞质雄性不育花椰菜保持系特异分子标记的鉴定及序列分析

以花椰菜细胞质雄性不育系NK-6和相应保持系NK-6B为材料进行RAPD分析,筛选了406条RAPD引物,共获得了2160条清晰可辨的条带,平均每个引物产生5-10条。其中引物S2121在两系的扩增中表现出多态性,在保持系中特异扩增出一条934bp的片段。克隆、测序,根据测序结果设计特异性引物,将RAPD标记转化成特异PCR标记,命名为S2121900。经Southern点杂交分析及对单株和多份候选材料的检测证实该标记为花椰菜保持系所特有,可用于候选保持系的早期筛查。序列分析表明该片段与油菜、拟南芥线粒体上的序列有较高相似性,因此推测该片段亦可能来源于线粒体基因组。本研究为从另一角度解释花椰菜细胞质雄性不育的分子机制提供了新线索。     

粘类小麦细胞质雄性不育系的RAPD分析

利用250条10-聚寡核苷酸随机引物对具粘果山羊草(Aegilops kotschyi)、易变山羊草(Ae.variabilis)、偏凸山羊草(Ae.ventricosa)和二角山羊草(Ae．bicornis)细胞质不育系及其保持系5-1的总DNA进行了RAPD多态性分析,其中31条引物对4种不育系及其保持系总DNA均无扩增,217条引物扩增条带完全相同。有2条随机引物在2种不育系之间有特异的扩增片段,其中引物S22在偏凸山羊草细胞质雄性不育系基因组DNA中扩增出分子量约为1600bp的特异带,引物S202在粘果山羊草细胞质雄性不育系基因组DNA中扩增出约1300bp特异带。线粒体基因组DNA的RAPD分析表明,4种不育系及其保持系mtDNA存在明显的差异。证明了S22—1600为偏凸山羊草细胞质不育系及其mtDNA基因组DNA的RAPD特异片段．S202—1300可能为粘果山羊草细胞质不育系及其ctDNA基因组DNA的RAPD特异片段。     

洋葱细胞质雄性不育系101A的分子鉴定

根据文献报道设计引物序列,对洋葱细胞质雄性不育系101A进行PCR扩增,结果表明:洋葱细胞质雄性不育系101A属于S型细胞质雄性不育类型,其特异片段位于叶绿体基因组。     

洋葱细胞质雄性不育系70及其保持系71基因组DNA的RAPD分析

采用RAPD技术,对洋葱细胞质雄性不育系70及其保持系71的基因组DNA的多态性进行分析。结果表明,在被检测的100条随机引物中,46条引物具有扩增产物,5条引物扩增出多态性条带。对这5条引物进行重复筛选和单株验证,只有G02扩增出的多态性片段,且表现稳定。推测该标记与育性有关。     

不结球白菜新种质P70-203雄性不育细胞质类型的鉴定

本研究根据OguraCMS、PolimaCMS的不育性状相关的线粒体基因序列设计特异引物,对不结球白菜雄性不育系新种质P70-203及其保持系P60-27-1进行PCR分析.研究结果表明,Polima引物P3/P4,P5/P6在不育系与可育系中均无扩增条带;Ogura引物P1/P2在不育系中扩增出750 bp的特异片段,但可育系中无扩增条带.将扩增的特异条带回收并测序,将得到的测序结果在NCBI中进行Blastn同源性比较,结果与青花菜Ogura(登录号:EU604643)和萝卜Ogura(登录号:AB055438)细胞质雄性不育同源性均达到99%.从分子角度初步推测:该雄性不育系新种质P70-203具有Ogura细胞质.     

红麻UG93细胞质雄性不育系、保持系及恢复系间的遗传多样性分析

利用8条核基因组ISSR引物和7对叶绿体基因组SSR引物(cpSSR),对9对红麻UG93细胞质雄性不育系/保持系及5个恢复系的细胞核、细胞质遗传多样性进行分析.结果表明:各材料的核基因组遗传相似系数在0.333～1.000之间,其中保持系间、保持系和恢复系间、恢复系间的平均相似系数分别为0.583、0.689和0.8...     

大白菜细胞质雄性不育系和其保持系的RAPD分析

利用RAPD技术对大白菜细胞质雄性不育系CMS341-7和其保持系3411-7的基因组DNA进行了比较分析,共使用了269个随机引物,其中有163个引物在两系之间都得到了扩增产物,79个引物扩增结果在两系之间表现出了遗传多态性。找到了不育系和保持系的特异扩增条带CMSOPL01670和MOPB04600。并对这些特异片段的来源及其在细胞质雄性不育中的作用进行了讨论。     

水稻孢子体细胞质雄性不育系线粒体DNA的RAPD分析

利用200个10nt随机引物对水稻孢子体细胞质雄性不育系珍汕97A、保持系珍汕97B、F1代汕优63、恢复系明恢63和另一种孢子体细胞质雄性不育系马协A、保持系马协B、F1代马协63的线粒体DNA进行PCR扩增。在36℃的退火温度下,有132个引物扩增出了清晰的、重复性较好的条带。同一组合内的不育系同保持系、恢复系之间线粒体DNA随机引物扩增产物的多态性明显高于不育系与F1代。不育系与F1代线粒体DNA的扩增产物也存在多态性。一些特异性的差异片段可能与水稻CMS相关。     

细胞质雄性不育高粱叶绿体 ndh D 基因的序列变异

片段SAAU－02 700特异地扩增自7种具可育细胞质的高粱材料的总DNA,含有叶绿体psa C(88bp)和ndh D(192bp)基因的部分序列。该片段与Eco Ri HindⅢ酶切的总DNA,线粒体DNA和叶绿体DNA杂交,在总DNA中获得了0.74kb的杂交带,而在叶绿体中获得0.74kb和0．45kb两条杂交带。与线粒体DNA无杂交;与经Hae Ⅲ酶切的总DNA杂交,在不育系中获得4．9kb的杂交带,而保持系的杂交带为4．45kb。参考GenBank中高粱的近缘物种玉米叶绿体基因组的序列,构建了ndh D基因区的酶切位点图谱,借此分析得出高粱不育系的叶绿体ndh D基因序列已发生改变。这种变异与高粱细胞质雄性不育反生的关系正在探讨中。     

甘蓝型油菜细胞质雄性不育系301A线粒体不育基因片段分析

提取细胞质雄性不育系301A、212A和'陕3A'及其共同保持系'中双2号'线粒体DNA,根据已报道的Polima油菜细胞质雄性不育相关基因orf224序列设计引物,对3种不同来源的线粒体DNA PCR产物进行分析.结果显示,这3种甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料所获得片段序列完全一致,且与已报道的Polima油菜线粒体中细胞质雄性不育相关基因orf224序列完全相同.研究表明,不育材料301A从分子角度讲属于Polima系统,不育系301A、212A和'陕3A'线粒体中与细胞质雄性不育相关线粒体基因片段orf224具有高度同源性.     

苎麻细胞质雄性不育"三系"ISSR特异片段克隆和序列分析

利用ISSR分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育"三系"mtDNA进行多态性分析;在选用的38个IS-SR引物中,有6个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克隆和序列测定,结果表明:片段21-MS全长956bp,包含一个525bp的完整编码区,共编码174个氨基酸。片段31-M/R全长778bp,包含一个404bp的不完整编码区,共编码134个氨基酸;其核苷酸和氨基酸序列与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71～76和73～77的同源性。     

苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR 特异片段克隆和序列分析

利用ISSR 分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育“三系”mtDNA 进行多态性分析; 在选用的38 个ISSR引物中, 有6 个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克隆和序列测定, 结果表明: 片段21-MS 全长956 bp , 包含一个525 bp 的完整编码区, 共编码174 个氨基酸。片段31-M􊄯R 全长778 bp , 包含一个404 bp 的不完整编码区, 共编码134 个氨基酸; 其核苷酸和氨基酸序列与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71%～76%和73%～77%的同源性。     

花椰菜细胞质雄性不育基因特异PCR标记的筛选

基于同源序列的候选基因法(homology-based candidate gene method),通过检索NCBI核酸及蛋白数据库,获得细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility CMS）相关的基因或开放读码框。生物学软件分析,根据保守区设计5对特异引物,PCR扩增,其中引物P9/P10在花椰菜细胞质雄性不育系knxd612中特异扩增出313 bp的片段。单株检测,RT-PCR分析,斑点杂交鉴定,确定此片段为花椰菜细胞质雄性不育系knxd612所特有。序列分析表明该片段与Ogura型胞质不育萝卜,不育相关开放读码框orf138的同源性高达98％。初步结果显示实验所用不育花椰菜胞质亦可能为Ogura型。该结果为进一步从分子水平研究花椰菜细胞质雄性不育打下了坚实的基础。Abstract: The homology-based candidate gene method was used to identified the specific PCR markers linked to cytoplasmic male sterility (CMS) in cauliflower( Brassica oleracea var botrytis.).Searching the DNA and protein data-base of NCBI , correlative genes or open reading frames were indentified .Analysis of biosoft, based on the conservative regions ,five primers were designed . Among them, only primer P9/P10 produced a 313- bp specific fragment. Identified by individual plant testing , analysis of RT-PCR and dot blot ,this fragment was only existed in CMS cauliflower knxd612.Analysis of the sequence indicated it was high homologous(98%) with orf138 of Ogura CMS radish. Primary result suggested that the cytoplasmic type of CMS cauliflower knxd612 may belong to Ogura type. This research offered a good foundation to further investigate the CMS mechanism of cauliflower in molecular level.     

Highly informative nature of inter simple sequence repeat (ISSR) sequences amplified using tri- and tetra-nucleotide primers from DNA of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.).

Inter simple sequence repeat (ISSR) sequences as molecular markers can lead to the detection of polymorphism and also be a new approach to the study of SSR distribution and frequency. In this study, ISSR amplification with nonanchored primer was performed in closely related cauliflower lines. Fourty-four different amplified fragments were sequenced. Sequences of PCR products are delimited by the expected motifs and number of repeats, which validates the ISSR nonanchored primer amplification technique. DNA and amino acids homology search between internal sequences and databases (i) show that the majority of the internal regions of ISSR had homologies with known sequences, mainly with genes coding for proteins implicated in DNA interaction or gene expression, which reflected the significance of amplified ISSR sequences and (ii) display long and numerous homologies with the Arabidopsis thaliana genome. ISSR amplifications revealed a high conservation of these sequences between Arabidopsis thaliana and Brassica oleracea var. botrytis. Thirty-four of the 44 ISSRs had one or several perfect or imperfect internal microsatellites. Such distribution indicates the presence in genomes of highly concentrated regions of SSR, or "SSR hot spots." Among the four nonanchored primers used in this study, trinucleotide repeats, and especially (CAA)5, were the most powerful primers for ISSR amplifications regarding the number of amplified bands, level of polymorphism, and their nature.     

胞质雄性不育相关基因的克隆及其表达分析

根据GenBank中orf224和atp6基因的保守序列设计特异引物,对不结球白菜Pol胞质雄性不育系的基因组DNA进行特异扩增,获得了Pol胞质雄性不育的特异基因orf224和atp6的DNA序列.用Blastn在GenBank中进行同源性比对分析,发现不结球白菜orf224c和atp6c基因与已报道的orf224和atp6基因的同源性高达100%,在GenBank中的登录号依次为DQ400846、DQ412559.运用半定量RT-PCR对orf224c基因在不同器官中的表达水平进行分析,结果表明:不育系花期叶片中该基因的表达量比长度小于0.5 mm蕾和雄蕊中的明显低,在后2个器官中的表达量无明显差异;而在保持系的上述3个器官中的表达量无明显差异.该结果显示orf224基因表达上调与孢原细胞分化受阻相关.     

BT型细胞质雄性不育水稻及其三系的线粒体DNA研究

用RAPD技术对BT型水稻胞质雄性不育系秀A及其保持系秀B、恢复系湘晴以及杂种F1代的线粒体DNA进行了比较分析。结果表明不育系与其保持系间存在显著差异;不育系与其F1之间mtDNA也存在差异。在引物OPJ－08的扩增产物中,秀A扩增出一条分子量为800bp的多态性片段,在引物OPK－10的扩增产物中,杂种F1扩增出一条分子量为900bp的片段。把这两片段回收、克隆并制备探针,OPJ－08800的Southern杂交结果显示不育系与其F1杂交图谱存在多态性;OPK－10900的Suthern杂交结果显示不育系与其保持系同存在差异。推测这两片段与育性可能有一定的联系。     

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S4181515。序列分析表明S4181515为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40％,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S4181515转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。