低温胁迫后抗寒茶树品种‘紫阳圆叶’的基因差异表达分析

采用DDRT—PCR技术,对低温（4℃）胁迫处理不同时间（0、8、12、24和48h）后茶树[Camellia sinensis（Linn．）O．Ktze．]抗寒品种‘紫阳圆叶’（‘Ziyangyuanye’）叶片中差异表达的基因进行分离和测序,并采用半定量RT-PCR对差异表达基因的表达特性进行了比较。结果表明：有12个引物对扩增出有明显差异的cDNA片段,其中3个片段是与抗寒性相关的差异片段,分别被命名为Csgsf．Cscafl和Cscaf2,碱基数分别为217、316和232bp。比对结果显示：Cscaf与茶树品种‘安吉白茶’（‘Anjibaicha’）和‘龙井43’（‘Longjing43’）的谷氨酰胺合成酶基因的同源性分别为96％和91％,与菜豆（Phaseolus vulgaris Linn．）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn．）、油棕（ElaeisguineensisJacq．）、西洋参（Panax quinquefolius Linn．）和水稻（Oryza sativa Linn．）等植物的谷氨酰胺合成酶的基因序列同源性均达到90％以上,因此,Cscafl应为茶树谷氨酰胺合成酶基因片段;Cscaf2与干旱胁迫条件下茶树表达的cDNA的同源性为100％,为茶树应答干旱和低温胁迫的基因片段;Cscafl未检索出同源序列,推测其为与冷胁迫相关的未知基因片段。半定量RT—PCR分析结果表明：Cscafl和Cscafl在低温胁迫的初始期即开始表达且表达量随低温胁迫时间延长逐渐下调;而Cscaf2的表达量随低温胁迫时间延长逐渐上调并在胁迫48h后达到最大,3个片段的表达特性均与差异扩增结果相符。     

猕猴脑胱天蛋白酶-3活化及其靶蛋白的体外研究(英)

凋亡的主要生化过程包括胱天蛋白酶的活化及其对细胞内蛋白质的选择性切割.在已知的胱天蛋白酶中,可被多种凋亡刺激信号激活的胱天蛋白酶-3备受注目.为进一步揭示灵长类动物神经组织中未知的胱天蛋白酶-3靶蛋白,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,通过加入granzyme B引发凋亡途径的部分反应,如胱天蛋白酶-3的活化及随后发生的蛋白质水解.经蛋白质印迹分析发现,与granzyme B共孵育后,猕猴脑胱天蛋白酶-3以两步方式从酶原转化为活性酶.对猕猴脑组织自身蛋白质的进一步分析显示,多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）被水解为长85 ku的片段,此片段提示胱天蛋白酶-3的特异切割活性.此外,神经元凋亡抑制蛋白（NAIP）也被切割,产生长约40 ku的小片段,但是它的出现不被胱天蛋白酶-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO阻断,因此可能是granzyme B直接作用于NAIP所致.以上结果提示,凋亡相关酶切反应可在成年猕猴脑组织提取物中得到重现;NAIP可能是granzyme B而非胱天蛋白酶-3的作用靶点.     

颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对肌动蛋白水解作用的体外研究

已知凋亡过程的基本变化之一是细胞骨架的异常,后者在某种程度上决定凋亡细胞的形态学特征.为揭示凋亡相关蛋白酶--颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对胞浆型肌动蛋白的水解作用,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,以外源性颗粒酶B触发凋亡途径的终末反应.经一系列免疫印迹分析发现:孵育12 h方见β-肌动蛋白被剪切,产生41 ku和15 ku水解片段,并证明该水解反应为颗粒酶B依赖;颗粒酶B活化的内源性胱天蛋白酶-3和重组胱天蛋白酶-3均不能水解脑提取物中的β-肌动蛋白,尽管胱天蛋白酶-3可作用于纯化的肌动蛋白,产生15 ku片段.以上结果提示,内源性β-肌动蛋白对凋亡相关蛋白酶,尤其胱天蛋白酶-3不敏感,这可能与该蛋白质的空间结构特征或脑组织中存在的某种蛋白酶抑制因子有关.     

茶树叶片总RNA提取方法的比较研究

针对茶树叶片中富含多酚类物质的特点,以陕西地方茶树代表种质紫阳槠叶种的叶片为材料,比较了Trizol法、异硫氰酸胍法和改良SDS-酸酚法三种不同的总RNA提取方法。结果表明改良SDS-酸酚法能够从新鲜叶片、冷冻叶片和干燥叶片中提取到质量高、完整性好的总RNA,经检测28SrRNA亮度为18SrRNA的2倍,A260/A280值介于1.83～2.01之间。以鲜叶、冻叶和干燥叶片的总RNA为材料,进一步用于DDRT-PCR分析,均可获得清晰稳定的多态性结果。说明改良的SDS-酸酚法能抑制茶树叶片中多酚类物质对总RNA提取的影响,是一种适于茶树叶片总RNA提取的有效方法。     

丹参MSAP分子标记技术体系的优化及其应用

以陕西省野生丹参为材料利用正交设计对MSAP预扩增和选择性扩增体系中关键因素优化筛选,以建立适合丹参的MSAP反应体系,并用于5个野生丹参居群表观遗传多样性分析.结果表明:25μL MSAP双酶切反应体系中加入EcoRⅠ和MspⅠ各10 U,37℃酶切8 h,酶切较充分;最佳预扩增反应体系25μL,包含连接产物2.5μL,Mg2+(25 mmoI/L)1.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.4μL,上下游引物E00/HM00(50ng/μL)各1.0μL;最佳选择性扩增反应体系25μL,包含稀释100倍的预扩增产物1.5 μL,Mg2+(25 mmol/L)2.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.1μL,上下游引物E-ACG/HM-CAA(50 ng/μL)各0.8μL.选用5对引物组合对5个野生丹参居群的50个单株进行表观遗传多样性分析,平均DNA甲基化多态性谱带为95.48%;UPGMA聚类分析结果表明,50个丹参单株在相似性系数0.58处可分为3大类.     

泛素偶联酶2C促进肺癌细胞增殖和迁移与抑制细胞衰老

泛素偶联酶2C与多种肿瘤细胞的增殖密切相关,但其与肺癌发生和发展的关系尚不明确。 本研究以肺癌A549细胞为材料,通过RT-PCR、Western印迹、免疫荧光、SA-β-Gal细胞衰老染色、细胞划痕和Trans-well实验,阐明UBE2C与肺癌细胞的增殖、衰老和迁移能力的关系。结果显示,UBE2C在肺癌细胞中的表达明显高于正常细胞。利用基因修饰技术瞬时过表达或靶向沉默UBE2C后,在肺癌A549细胞中,UBE2C的mRNA和蛋白质水平显著增加3.5倍或减少0.5倍,显著促进或抑制细胞增殖,进而减少或增加细胞的凋亡率。过表达UBE2C后,显著抑制细胞衰老;但沉默UBE2C后,则增加细胞衰老。此外,过表达UBE2C后,下调转移相关基因E-钙黏着蛋白的mRNA和蛋白质表达水平,且上调波形蛋白基因的表达水平,进而促进肺癌细胞的迁移。但靶向敲除UBE2C后,上调E-钙黏着蛋白,同时下调波形蛋白表达水平,进而抑制肺癌细胞的迁移。本研究的开展将明确UBE2C在肺癌中的作用及其机制,为以UBE2C为靶点,提高病人生存期提供了理论基础。     

腹腔镜手术对子宫内膜异位症患者心理状态、免疫功能、生活质量及预后的影响

目的:探讨腹腔镜手术对子宫内膜异位症(EM)患者心理状态、免疫功能、生活质量以及预后的影响。方法:选择2015年7月-2016年6月在我院接受治疗的EM患者76例,采用随机数字表法将患者分为观察组和对照组各38例。对照组给予开腹手术治疗,观察组给予腹腔镜手术治疗。比较两组患者术前、术后3个月的生存质量测定量表(QOL-BREF)评分、汉密尔顿抑郁自评量表(HAMD)评分以及汉密尔顿焦虑自评量表(HAMA)评分,比较两组患者术前、术后1d的IgG、IgM、IgA的水平,并比较两组患者术后的不良反应和1年内的复发率。结果:术后3个月,两组的心理状态、生理领域评分以及总评分均高于术前,且观察组的心理状态、生理领域评分以及总评分均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);两组患者术后3个月的HAMD、HAMA评分均较术前显著降低,且观察组低于对照组(P0.05)。术后1d,两组患者的IgG水平较术前明显下降,且观察组的IgG水平高于对照组(P0.05);两组患者术后的潮热、阴道出血、性欲下降发生率比较无统计学差异(P0.05);术后随访1年,两组患者的复发率比较无统计学差异(P0.05)。结论:腹腔镜手术能显著改善EM患者的心理状态和生活质量,且对免疫功能的影响较小,同时不良反应轻微,复发率较低,患者预后良好,值得临床推广应用。     

颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对肌动蛋白水解作用的体外研究(英)

已知凋亡过程的基本变化之一是细胞骨架的异常,后者在某种程度上决定凋亡细胞的形态学特征.为揭示凋亡相关蛋白酶——颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对胞浆型肌动蛋白的水解作用,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,以外源性颗粒酶B触发凋亡途径的终末反应. 经一系列免疫印迹分析发现: 孵育12 h方见β-肌动蛋白被剪切,产生41 ku和15 ku水解片段,并证明该水解反应为颗粒酶B依赖;颗粒酶B活化的内源性胱天蛋白酶-3和重组胱天蛋白酶-3均不能水解脑提取物中的β-肌动蛋白,尽管胱天蛋白酶-3可作用于纯化的肌动蛋白,产生15 ku片段. 以上结果提示,内源性β-肌动蛋白对凋亡相关蛋白酶,尤其胱天蛋白酶-3不敏感,这可能与该蛋白质的空间结构特征或脑组织中存在的某种蛋白酶抑制因子有关.     

一种新型的截短型转化生长因子βⅡ型受体在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

克隆人源的截短型转化生长因子βⅡ型受体（tTGF-βRⅡ）,成功构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株。采用PCR技术扩增得到目的基因tTGF-βRⅡ,插入原核表达载体pGEX4T3的相应位点,并在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高可溶性表达的重组蛋白,重组蛋白GST-tTGF-βRⅡ经Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,再经凝血酶酶切,然后经Glutathione-Sepharose 4B纯化获得目的蛋白tTGF-βRⅡ,SDS-PAGE分析表明：可以通过Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化得到GST-tTGF-βRⅡ,其分子量约37.0 KDa,和目的蛋白tTGF-βRⅡ,分子量为11.0 KDa。Western blot结果显示GST-tTGF-βRⅡ和tTGF-βRⅡ为特异性蛋白。运用基因工程的方法获得tTGF-βRⅡ目的蛋白,对瘢痕成纤维细胞增殖具有很好抑制作用。     

猕猴脑胱天蛋白酶-3活化及其靶蛋白的体外研究

凋亡的主要生化过程包括胱天蛋白酶的活化及其对细胞内蛋白质的选择性切割.在已知的胱天蛋白酶中,可被多种凋亡刺激信号激活的胱天蛋白酶-3备受注目.为进一步揭示灵长类动物神经组织中未知的胱天蛋白酶-3靶蛋白,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,通过加入granzyme B引发凋亡途径的部分反应,如胱天蛋白酶-3的活化及随后发生的蛋白质水解.经蛋白质印迹分析发现,与granzyme B共孵育后,猕猴脑胱天蛋白酶-3以两步方式从酶原转化为活性酶.对猕猴脑组织自身蛋白质的进一步分析显示,多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)被水解为长85 ku的片段,此片段提示胱天蛋白酶-3的特异切割活性.此外,神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)也被切割,产生长约40 ku的小片段,但是它的出现不被胱天蛋白酶-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO阻断,因此可能是granzyme B直接作用于NAIP所致.以上结果提示,凋亡相关酶切反应可在成年猕猴脑组织提取物中得到重现;NAIP可能是granzyme B而非胱天蛋白酶-3的作用靶点.