PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

目的: 确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法: 将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1^WT, pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156~509), pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156~581), pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果: Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论: PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。     

酪氨酸羟化酶基因载体－pCMVTH 质粒的构建及在大鼠骨骼肌内的表达

为用转基因方法治疗巴金森氏病大鼠模型,本研究采用分子克隆技术,将合成多巴胺的关键酶－酪氨酸羟化酶（ＴＨ）的基因,克隆进入以巨细胞病毒ＣＭＶ为启动子的载体质粒内,经限制性内切酶定位分析证实该重组的ＤＮＡ质粒的可靠性。携带ＴＨ基因的ＰＣＭＶＴＨ质粒以ＬＩＰＯ－ＦＥＣＴＩＮ介导,在培养的原代骨骼肌细胞中高效表达。本研究为进一步用转基因的细胞植入脑内以治疗巴金森氏病打下一定基础。     

过表达PINK1抵抗鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤的研究

目的:明确在C57BL/6小鼠纹状体过表达野生型的人源帕金森相关蛋白PINK1能否减轻由侧脑室注射鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤。方法:通过向C57BL/6小鼠(雄性,7周龄,18~20g)左侧纹状体中注射带有GFP人源野生型PINK1及突变体PINK1^G309D的慢病毒包装颗粒,两周后向小鼠左侧侧脑室中定位注射鱼藤酮,通过蛋白质印迹,免疫组化和行为学的方法检测PINK1对鱼藤酮引起多巴胺神经元损伤的影响。结果:蛋白质印迹和免疫组化的实验都证明了在C57BL/6小鼠纹状体过表达野生型的PINK1对于鱼藤酮引起多巴胺能神经元的减少有明显的抑制作用(P<0.01),但对鱼藤酮引起的行为学损伤没有明显的改善作用。     

农药鱼藤酮对表达α-突触核蛋白细胞的作用

本研究利用农药鱼藤酮作用于神经细胞 ,观察鱼藤酮对神经细胞的损伤作用以及线粒体功能障碍与α- synuclein积聚之间的关系。方法 :本实验选用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y ,实验组为α-synuclein GFP基因转染的细胞 ,鱼藤酮处理的转基因细胞和非转基因细胞 ,对照组为未处理的SH-SY5Y细胞。通过RT-PCR检测α-synuclein基因转染细胞的基因表达情况。荧光显微镜观察细胞内α-synuclein GFP表达产物绿色荧光蛋白。MTT法检测各组细胞活性。DCF检测细胞氧应激。HE染色、免疫组化检测α-synuclein在细胞中的状态。电镜观察细胞超微结构的改变。结果 :RT-PCR显示转基因细胞α-synuclein基因的表达。荧光显微镜观察显示细胞浆内可见绿色荧光蛋白 ,绿色荧光分布不均匀 ,可见蛋白积聚。MTT检测结果显示 ,与对照组相比 ,鱼藤酮处理的细胞增殖速度明显减小 (P <0. 01 )。鱼藤酮的浓度为 75nmol/ L、1 0 0nmol/ L时 ,未转基因与转基因的细胞活性相比较 ,前者的细胞活性低于后者 (P <0 .0 5 )。HE染色 ,鱼藤酮处理的转基因细胞胞浆减少、转基因细胞胞浆内也可见自噬体。胞浆内有嗜酸性包涵体样结构。免疫组化可见鱼藤酮处理高表达α-synuclein细胞明显变成梭形并有很长的突起。电镜显示鱼藤酮处理的细胞线粒体肿胀 ,嵴断裂 ,胞浆内形成自噬体。DCF检测转基因细胞内存在明显的氧化应激 ,并随鱼藤酮处理加重。结论 :农药鱼藤酮对多巴胺能神经细胞有明显的损伤作用 ,转基因细胞显示对较高浓度的鱼藤酮损伤有一定的耐受作用。α-synuclein可引起神经细胞的氧化应激并随鱼藤酮处理加重。提示环境因素可能与α-synuclein表达相互作用使多巴胺能神经元氧化应激进行性加重 ,这可能是引起PD的主要原因。     

人甘丙肽2型受体基因启动子的克隆与初步功能分析

人甘丙肽2型受体(GalR2)作为G蛋白偶联受体,其功能已被广泛研究,但GalR2基因的转录调控机制尚不明确.我们利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增人GalR2基因上游1121bp的片段,再通过PCR方法将其缺失成3段长度不等的片段,然后分别将其克隆到荧光素酶报告基...     

α-突触核蛋白N-端结构域参与线粒体功能的调控

目的：确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法：构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达α-Synuclein蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞MN9D,通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及Cytochrome c释放。结果：成功构建了pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N融合蛋白质粒,免疫共沉淀明确α-Synuclein N-端为其功能结构域,JC-1染色发现N-端使线粒体膜电位降低,流式细胞术证实N-端使Cytochrome c释放明显增加。结论：α-Synuclein N-端是其与线粒体相互作用的功能结构域,N-端降低线粒体功能。     

帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白相互作用研究

目的 利用蛋白质组学方法和激光扫描共聚焦显微镜来鉴定帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白（α-synuclein）之间的相互作用关系及两种蛋白在MN9D细胞中的分布。方法 将α-synuclein基因插入pGEX-4T-1载体,经DNA测序证明形成GST融合蛋白,经大肠杆菌BL-2l表达纯化后,与MN9D细胞裂解液共孵育,检测PINK1与α-synuclein蛋白间的相互作用。并应用MN9D细胞的内源性PINK1与α-synuclein进行免疫共沉淀实验,进一步验证两蛋白之间的相互作用。MN9D细胞经免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的细胞内分布及共定位状态。结果 利用GST-α-synuclein融合蛋白捕获及免疫共沉淀技术,检测到特异的PINK1条带。激光扫描共聚焦显微镜检测到两者存在部分共定位。结论 PINK1和α-synuclein在体外和细胞内均可发生相互作用并在MN9D细胞中存在共定位关系。     

骨髓基质细胞的分离、鉴定以及TH基因的转染与表达

目的是探索骨髓基质细胞的分离培养、鉴定及其接受并表达TH基因的能力。实验中通过密度梯度离心法成功地从成年SD大鼠骨髓中分离获得了骨髓基质干细胞 ,并用流式细胞仪对其进行鉴定 ,纯度可达 75 %。进一步采用复制缺陷型腺相关病毒载体介导的基因转染方法 ,将之改造成为携带lacZ与TH基因的工程细胞 ,经X gal染色和TH免疫组化检测 ,转染效率为 (74 .6± 19.4 ) %。实验结果表明骨髓基质细胞易于接受并表达外源基因 ,有望作为运载细胞应用于帕金森病的基因治疗。     

原子力显微镜检测过表达α-突触核蛋白引起的线粒体结构变化

目的：利用原子力显微镜等方法,明确α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）过表达对线粒体的影响。方法：将腺相关病毒（AAV）载体介导表达的α-syn (AAV /α-syn)病毒包装颗粒,给大鼠脑内黑质区定位注射,建立α-syn过表达的大鼠模型,并以AAV介导表达的报告基因LacZ (AAV/LacZ)为动物对照组。提取大鼠黑质脑组织的线粒体,并通过JC1染色检测线粒体膜电势（ΔΨ）变化和Western Blot检测线粒体中α-syn蛋白量的变化;采用原子力显微镜观测线粒体表面结构的变化。结果：实验组大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,Western blot显示线粒体中α-syn蛋白量增加约2倍;JC1染色发现ΔΨ下降;原子力显微镜观测可见线粒体体积增大,线粒体膜表面出现较多孔道样改变。结论：大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,可导致α-syn蛋白在线粒体积聚;并可引起线粒体增大、膜形成孔道样改变、ΔΨ下降。     

α－synuclein对小剂量鱼藤酮导致的线粒体损伤的调控作用研究

建立稳定表达 -synuclein基因的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞,,鱼藤酮作用1、2、4周后分别提取各组细胞线粒体,检测其complexⅠ功能、线粒体膜肿胀度和超氧阴离子的含量。结果显示在1、2周时过表达 -synuclein基因的细胞与对照组细胞相比,前者的complexⅠ的活性高,线粒体膜肿胀度轻,线粒体超氧阴离子的含量少。但4周后,前者的complexⅠ活性明显低于后者,且线粒体膜肿胀度及线粒体内超氧阴离子的含量均显示前者高于后者,也是前者多于后者。由此可见过表达 -synuclein基因的细胞在早期对鱼藤酮的损伤有一定的抵抗作用,但长期作用后可能有加重损伤的作用。提示PD患者多巴胺能神经元内 -synuclein的增高可能对小剂量鱼藤酮导致的线粒体损伤存在双重调节作用,初期可能由于 -synuclein上调引起的预适应改变起到一定的保护作用。而失代偿后,可能由于神经元内积累的 -synuclein聚变,对线粒体膜稳定性的损伤,导致神经元变性死亡。